IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值在乙型肝炎相关肝硬化中的临床价值

吴苏君， 冀恒涛， 彭梦乐

（1.河南省直第三人民医院检验科，河南 郑州 450000；2.郑州大学第二附属医院检验科，河南 郑州 450000）

有流行病学调查结果显示，全球有超过3亿人感染或携带乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），我国为HBV感染高发国家，HBV感染者高达1.3亿[1]。机体感染HBV后会产生抗病毒免疫应答，一方面可清除病毒，使部分患者病情得到缓解，但抗病毒免疫应答也可促进机体发生炎性反应，导致肝脏受到损伤或坏死，严重时可导致肝硬化或肝癌的发生[2]。有10%～30%的HBV感染者会发展为肝硬化或肝癌[3]。因此，寻找能有效诊断乙型肝炎（简称乙肝）相关肝硬化的指标具有重要意义。肝脏固有免疫参与了肝硬化的发生、发展[4]，固有免疫细胞主要为自然杀伤（natural killer，NK）细胞和树突状细胞（dendritic cell，DC）。在慢性HBV感染中，NK细胞可通过溶细胞途径或非溶细胞途径发挥抗病毒作用，而DC主要通过分泌Ⅰ型干扰素或细胞因子在固有免疫中发挥作用[5]。NK细胞与DC之间可通过相互作用来调节机体的免疫功能。固有免疫细胞的大量聚集会导致炎症级联反应的发生[6]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor 3，NLRP3）作为机体固有免疫的主要成分，在自身免疫性疾病、慢性炎症性疾病等病理过程中起重要作用[7]。NLRP3的活化可介导其下游因子白细胞介素18（interleukin-18 ，IL-18）、白细胞介素37（interleukin-37，IL-37）等的表达。本研究拟探讨IL-18、IL-37、NLRP3水平及外周血NK/DC比值在乙肝相关肝硬化中的临床意义。

1 材料和方法

1.1 一般资料

选取2017年5月—2019年5月河南省直第三人民医院乙肝相关肝硬化的初诊患者129例（乙肝相关肝硬化组），其中男69例、女60例，年龄（41.5±5.6）岁；ChildPugh分级[8]为A级49例、B级47例、C级33例。根据病情进展将129例患者进一步分为肝硬化组（98例）和原发性肝癌组（31例）。另选取同期河南省直第三人民医院乙肝患者129例（乙肝组），其中男72例、女57例，年龄（41.1±5.2）岁。以同期河南省直第三人民医院体检健康者129名作为正常对照组，其中男67名、女62名，年龄（42.2±6.1）岁。本研究经河南省直第三人民医院伦理委员会批准，所有对象均知情同意。

1.2 纳入和排除标准

1.2.1 纳入标准 （1）乙肝和乙肝相关肝硬化依据《慢性乙型肝炎防治指南（2015更新版）》[9]确诊，原发性肝癌依据《原发性肝癌诊疗规范（2017年版）》[10]确诊，健康体检者近1个月内体格检查无异常，相关血液学指标均正常；（2）年龄≥18周岁；（3）所有研究对象或其家属均知情同意。

1.2.2 排除标准 （1）有既往手术史；（2）非HBV因素所致的肝硬化；（3）合并其他心、脑血管疾病；（4）合并免疫功能障碍性疾病；（5）近6个月服用过免疫抑制剂等可能影响检测结果的药物；（6）精神状态异常或依从性差。

1.3 方法

收集所有对象的一般资料，包括性别、年龄、体质量指数（body mass index，BMI）、吸烟史、饮酒史、高血压史、糖尿病史。

采集所有对象入组次日清晨（未接受治疗前）的空腹静脉血5 mL×3管，其中2管采用枸橼酸钠抗凝，用于检测NK细胞、DC及NLRP3基因；1管分离血清，用于检测IL-18和IL-37。

采用 FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）及配套试剂检测NK细胞、DC百分比，计算NK/DC比值。采用酶联免疫吸附试验检测IL-18和IL-37，试剂盒购自美国Abcam公司[IL-18试剂盒的检出限为8.3 pg/mL，线性范围为62.5～4 000.0 pg/mL，变异系数（coefficient of variation，CV）为2.7%，标准曲线r2=0.994；IL-37试剂盒的检出限为10 pg/mL，线性范围为15.6～1 000.0 pg/mL，CV为4.1%，标准曲线r2=0.991]，检测仪器为Microlab STAR 多功能酶标仪（瑞士Hamilton公司）。

采用RNA提取试剂盒（美国Abcam公司）提取血细胞RNA，并用逆转录试剂盒（美国Abcam公司）进行逆转录反应。根据SYBR RTPCR试剂盒（美国Abcam公司）说明书，采用逆转录-聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）检测NLRP3基因表达。引物序列：NLRP3上游引物为5'-GCTGGTCTTGAATTCCTCA-3'，下游引物为5'-GGCAACGGATGAGTCTTT-3'；β-actin上游引物为5'-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3'，下游引物为5'-CGTACAGGTCTTTGCGG-ATG-3'。反应体系：10×扩增缓冲液10 μL、4种dNTP混合物（200 μmol/L）各0.5 μL、上游及下游引物（20 pmol/L）各1 μL，模板DNA 4.5 μL、1.5 mmol/L Mg2+3 μL，加双蒸水至100 μL。反应条件：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃30 s，循环35次。以β-actin为内参，采用2-△△Ct法计算各组NLRP3与β-actin基因的相对表达量。每份样本重复检测3次，取平均值。NLRP3的检测结果以β-actin表达量的倍数表示。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析；两两比较，若方差齐性，采用LSD-t检验；若方差不齐，采用Dunnett-t3检验。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值单项检测及联合检测鉴别诊断乙肝相关肝硬化与原发性肝癌的效能。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乙肝组、乙肝相关肝硬化组、正常对照组一般资料比较

乙肝组、乙肝相关肝硬化组及正常对照组年龄、性别、BMI、吸烟史、饮酒史、高血压史、糖尿病史差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 乙肝组、乙肝相关肝硬化组、正常对照组一般资料比较

2.2 乙肝组、乙肝相关肝硬化组、正常对照组IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值比较

正常对照组、乙肝组和乙肝相关肝硬化组IL-18、IL-37水平及NLRP3相对表达量依次升高，NK/DC比值依次降低（P<0.05），各组间4项指标差异均有统计学意义（P<0.001）。见表2。

表2 乙肝组、乙肝相关肝硬化组、正常对照组IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值比较

2.3 不同ChildPugh分级患者IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值比较

ChildPugh分级A级、B级和C级患者IL-18、IL-37水平及NLRP3相对表达量依次升高，NK/DC比值依次降低（P<0.05）；各分级间4项指标差异均有统计学意义（P<0.001）。见表3。

表3 不同ChildPugh分级患者IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值比较

2.4 肝硬化组与原发性肝癌组IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值比较

原发性肝癌组IL-18、IL-37水平及NLRP3相对表达量高于肝硬化组（P<0.05），NK/DC比值低于肝硬化组（P<0.05）。见表4。

表4 肝硬化组与原发性肝癌组IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值比较

2.5 4项指标鉴别诊断乙肝相关肝硬化和原发性肝癌的效能

采用二元回归分析法得出NLRP3、IL-18、IL-37、NK/DC比值的联合检测方程为：Logit（P）=-0.675+0.23×NLRP3+0.002×IL-18+0.001×IL-37-0.005×NK/DC比值。ROC曲线分析结果显示，NLRP3、IL-18、IL-37、NK/DC比值单项检测及4项指标联合检测鉴别诊断乙肝相关肝硬化与原发性肝癌的曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.893、0.886、0.860、0.838、0.982。见表5、图1。

表5 4项指标单独及联合检测鉴别诊断原发性肝癌的ROC曲线性能参数

图1 NLRP3、IL-18、IL-37和NK/DC比值鉴别诊断原发性肝癌的ROC曲线

3 讨论

HBV可在患者体内长期复制，导致机体持续处于“循环坏死和再生修复”这一病理过程中，诱使肝细胞发生纤维化，最终导致肝硬化的发生，若未及时发现并进行有效治疗，将发展为失代偿期肝硬化，甚至是原发性肝癌[11]。目前，临床上对肝硬化进行病情诊断及分期的金标准是肝脏活检[12]。但肝脏活检为有创检查，患者依从性小，且存在取样部位受病理医生主观影响大，无法长期监测或评估患者病情进展等不足。因此，寻找肝硬化患者病情监测及预后评估的特异性生物标志物具有十分重要的临床意义。

“炎症小体”这一概念最早由TSCHOPP等[13]提出，主要用于描述免疫细胞激活或其胞质中一类介导半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1（cysteine-containing aspartate-specific protease-1，Caspase-1）活化的大分子复合物。近年来，关于炎症小体在炎症性疾病发生、发展中的作用已成为临床研究的热点。NLRP3作为炎性小体之一，其可通过促进机体内炎症信号的激活，诱导其下游炎症因子，如IL-18等的表达，促进肝脏间质细胞的纤维化。NLRP3过表达还可促进机体中性粒细胞和巨噬细胞的富集，进一步促进炎性细胞对肝脏上皮细胞的吞噬以及促凋亡作用[13]。此外，NLRP3水平升高还可导致肝脏上皮细胞线粒体的损伤及线粒体膜结构功能的异常，进一步影响肝功能的恶化。有研究结果显示，当肝脏出现炎症时，NLRP3炎症小体水平显著升高，且肝脏组织中NLRP3、Caspase-1表达显著增加[14]。IL-18是NLRP3的下游因子，主要由肝脏Kupffer细胞及单核-巨噬细胞产生。IL-18可促进机体T细胞的表达，增强淋巴细胞的毒性[15]。IL-18可促进NK细胞凋亡相关因子配体（apoptosis related gene Fas ligand，FasL）的分泌，并可诱导辅助性T细胞（helper T cell，Th）1产生γ干扰素（interferon-gamma，IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）等细胞因子，刺激机体多种免疫细胞产生Fas，从而通过Fas/FasL信号通路发挥淋巴细胞的毒性作用[15]。IL-18还可促进肝细胞可溶性细胞间黏附分子1（soluble intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1）的表达，通过sICAM-1与其配体淋巴细胞功能相关抗原-l（lymphocyte functionassociated antigen-1，LFA-1）结合，介导T细胞与其他相关细胞黏附，促进机体的免疫应答，导致HBV感染者肝组织损伤的加重[15]。MERENDINO等[16]的研究结果显示，IL-18可促进肝细胞的炎性损伤。本研究结果显示，与正常对照者比较，乙肝患者及乙肝相关肝硬化患者IL-18水平及NLRP3相对表达量显著升高（P<0.05），且随肝硬化患者ChildPugh分级的升高而升高（P<0.05）；原发性肝癌患者IL-18水平及NLRP3相对表达量均高于乙肝相关肝硬化患者（P<0.05）。这提示NLRP3及其下游因子与HBV所致的肝炎及肝硬化的病理进程密切相关。

本研究结果显示，与正常对照者比较，乙肝患者及乙肝相关肝硬化患者IL-37水平升高（P<0.05），且随肝硬化患者ChildPugh分级的升高而升高（P<0.05）；原发性肝癌患者IL-37水平均高于乙肝相关肝硬化患者（P<0.05）。IL-37主要表达于淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞等细胞，是固有免疫反应的天然抑制因子，不仅可抑制炎症因子的表达，还可对固有免疫产生抑制作用，其机制可能是通过DC抑制CD8+T细胞的产生，促进调节性T细胞的表达，从而抑制机体固有免疫，产生免疫耐受[14]。在HBV感染的过程中，CD8+T细胞可对感染HBV的肝细胞进行免疫攻击，从而清除病毒，而调节性T细胞可抑制T细胞的表达，促进机体免疫耐受。因此，HBV感染患者IL-37水平上升可能会促进调节性T细胞的生成，抑制CD8+T细胞表达，从而加重患者肝脏损伤。

NK细胞及DC在机体固有免疫中发挥着重要作用。在HBV感染免疫清除期，患者外周血NK细胞数显著低于免疫耐受期及健康对照者，而NK细胞的活化能力则有所增强，并与肝脏损伤呈正相关[17]。在HBV慢性感染的过程中，DC可分泌IFN-γ，并作为抗原提呈细胞提高T细胞的活性，进而发挥抗病毒作用。刘斌等[17]的研究结果显示，NK/DC比值与NK细胞诱导DC分化发育密切相关，当NK细胞与DC的比例低于1∶5时，NK细胞可促进DC成熟；而当比例高于5∶1时，则会促进非成熟的DC凋亡，因此HBV感染患者NK/DC比值降低可能会促进DC成熟活化，进而增强T细胞的杀伤功能，导致肝损伤。本研究结果显示，与正常对照者比较，乙肝患者及乙肝相关肝硬化患者NK/DC比值显著下降（P<0.05），且随肝硬化患者ChildPugh分级的升高而降低（P<0.05）；原发性肝癌患者NK/DC比值低于乙肝相关肝硬化患者（P<0.05）。

由于慢性肝炎常会隐匿发展为肝硬化，多数患者因出现肝硬化失代偿期表现才得以被发现。目前，关于IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值在乙肝相关肝硬化预后评估中的价值的研究较少。本研究ROC曲线分析结果显示，NLRP3、IL-18、IL-37、NK/DC比值单项检测及4项指标联合检测鉴别诊断乙肝相关肝硬化与原发性肝癌的AUC分别为0.893、0.886、0.860、0.838、0.982，敏感性为77.4%～96.8%，特异性为71.0%～95.9%。

综上所述，IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值与乙肝相关肝硬化的发生、发展密切相关，在乙肝相关肝硬化与原发性肝癌的鉴别诊断中有一定的价值。但本研究为单中心研究，样本量较小，因此结论尚需大样本量、多中心的研究进一步验证。另外，本研究未探讨HBV DNA载量对IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值的影响及相关性，这也是后续研究的方向。