日本结缕草耐盐基因ZjbHLH106的克隆及序列分析

谢 琦

[1.深圳大学生命与海洋科学学院/广东省植物表观遗传学重点实验室，广东深圳 518060；2.深圳大学光电工程学院/光电子器件与系统(教育部/广东省)重点实验室，广东深圳 518060]

盐胁迫是影响植物生长、发育的重要生物胁迫之一，植物应对盐胁迫的生物学反应，在细胞、分子和生理水平上都已经有了较为清晰的阐述。盐胁迫调控是一个复杂的过程，涉及诸多因素包括脱落酸水平的增加，渗透保护剂、抗氧化剂和保护蛋白的积累等。胁迫诱导的基因产物不仅与耐受胁迫相关，同时也参与到基因表达调控、信号转导等。转录因子(TF)是植物体内重要的基因，很多类转录因子能特异响应外界环境的胁迫，调控逆境相关基因的表达，影响或者启动植物抗逆相关的生物学进程。在植物体内，已经鉴定出非常多的转录因子参与到植物的非生物胁迫调控路径。bHLH(basic helix-loop-helix)是一类重要的转录因子家族，其成员众多，在植物体内仅次于MYB转录因子家族。拟南芥中鉴定出了162个bHLH成员，在水稻中也鉴定出了167个bHLH成员。bHLH结构域约含60个氨基酸，包含了2个功能不同的结构域。DNA结合区域位于N端，约含有15个氨基酸，HLH(helix-loop-helix)区域主要由疏水残基组成，形成2个两亲的α螺旋，由1个可变长度的环区隔开，该区域位于结构域的C端末端，以二聚体形式起作用。bHLH转录因子通常识别和结合E-box序列(CANNTG)，如G-box序列(CACGTG)。bHLH家族基因与很多非生物类胁迫相关，例如基因(MYC-like bHLH)与植物的抗冻胁迫相关，参与了渗透胁迫相关的生物学反应，参与了寒冷胁迫，响应损伤及干旱胁迫。在拟南芥鉴定到了1个耐盐基因基因，该基因在拟南芥未分化的愈伤组织响应盐胁迫的诱导，并且缺失了的拟南芥突变体对NaCl敏感，且过表达的株系对盐胁迫的抗性增强。

本研究通过同源序列比对在结缕草基因组中鉴定和获得了基因，通过RT-PCR获得了该基因编码序列(CDS)，保守结构域分析发现该基因具有典型的bHLH结构域，并且通过盐胁迫处理以及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)研究该基因在盐胁迫下的表达量变化。鉴定和研究基因有助于研究和阐述结缕草耐盐相关的分子机理，并且为结缕草耐盐相关的分子改良育种工作提供了优质的候选基因。

1 材料与方法

1.1 材料准备

日本结缕草种子来源于北京林业大学草坪研究所，将日本结缕草种子放入水中浸泡24 h进行催芽处理，之后播种于直径15 cm的花盆中培养，营养土与蛭石体积比为3 ∶1。植物发芽后培养4周时间，之后用200 mmol/L的NaCl溶液浇灌处理，选取30 min、1 h、2 h、4 h、24 h及48 h的结缕草根，迅速放于超低温冰箱(-80 ℃)，以备后续试验使用。

1.2 RNA提取及cDNA合成

取200 mg结缕草根系样品，在液氮中充分研磨，通过TRIzol法(The InvitrogenTRIzolPlus RNA Purification Kit)提取样品的总RNA。取1 μg的总RNA，利用TAKARA的反转录试剂盒(PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit)，反转录成单链的cDNA，用于后续试验。

1.3 基因序列的分析及克隆

在拟南芥基因组中(https：//www.arabidopsis.org/)中下载基因序列(ID：AT2G41130)，通过同源序列比对在日本结缕草中鉴定的序列。利用NCBI在线引物设计程序(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)设计日本结缕草基因的引物(表1)，通过聚合链式反应(PCR)克隆目标基因。

1.4 启动子区域分析

根据日本结缕草提供的序列基因信息，将基因开放阅读框前2 000 bp序列作为启动子序列进行下载。利用在线软件PlantPAN 3.0(http：//plantpan.itps.ncku.edu.tw/promoter.php)分析基因的启动子序列。

1.5 实时荧光定量PCR分析

根据NCBI在线引物设计程序(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)，对目标序列进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的引物设计(表1)。利用TOYOBO公司的SYBR Green试剂盒(SYBRGreen Realtime PCR Master Mix)对基因进行qRT-PCR试验，内参序列选用Actin序列(表1)。

表1 引物序列及信息

2 结果与分析

2.1 日本结缕草bHLH106基因的扩增

拟南芥的基因响应盐胁迫诱导，可能在盐胁迫中参与了重要的作用。本研究通过登陆拟南芥网站(https：//www.arabidopsis.org/)，下载拟南芥序列(AT2G41130)，通过同源比对分析，在结缕草的基因组(http：//zoysia.kazusa.or.jp/)中进行同源序列比对，获得日本结缕草的序列(Zjn_sc00014.1.g08160.1.sm.mk)。根据所提供的序列设计特异性引物(表1中的bHLH_F和bHLH_R)，通过RT-PCR扩增出了包含完整编码区(CDS)的序列，测序发现总长度为1 120 bp，与目标序列基本一致(图 1)。

2.2 ZjbHLH106基因序列分析

在结缕草的参考基因组中，(结缕草基因ID：Zjn_sc00014.1.g08160.1.sm.mk)编码区内出现了63 bp未测通的序列(图2-A标注NNNN的区域)，这部分序列的遗失可能影响了该基因开放阅读框(ORF)的预测结果。测序结果发现，基因实际的CDS区域与基因组预测的ORF区域确实存在一定的差异，实际序列具有2个外显子和1个内含子，而基因组预测得到的ORF序列存在3个外显子和2个内含子。

除去这63 bp序列的差异，实际克隆的在CDS区域第340个碱基出现了T变成了G(亮氨酸L变成了缬氨酸V)，第646个碱基出现了A变G的情况(苏氨酸T变成了丙氨酸A)，这2个位点可能是SNP位点。通过NCBI保守结构域的寻找，在第1个外显子区域发现了bHLH的保守结构域(cd11455：bHLH_AtAIG1_like)，突变的位点存在于第2个外显子区域，可能该区域氨基酸的变化并不影响该蛋白功能。

2.3 ZjbHLH106基因启动子序列分析

在日本结缕草基因组中下载了基因CDS区域前2 000 bp作为启动子区域，通过PlantPAN 3.0在线软件分析，发现较多的启动子结合区域，并且存在很多比较典型的区域，比如花期相关的Dof、FAR1，生长素相关的Aux/IAA、ARF，花发育相关的MADS、SBP，非生物胁迫相关的bHLH、MYB、NAC等(表2)。启动子区域的分析预示着该基因可能在植物体内很多的生物学进程中受到了调控作用，直接或间接地参与到相关的生物学途径中。

表2 日本结缕草bHLH106启动子区域分析

2.4 盐胁迫处理对日本结缕草ZjbHLH106表达的影响

本研究对结缕草进行盐胁迫处理，提取盐胁迫处理后0 min(CK)、30 min、1 h、2 h、4 h、24 h和 48 h 的结缕草根系的RNA，反转录成单链cDNA，通过qRT-PCR(引物见表1)分析该基因的表达量水平，3个生物学重复取自不同单株的结缕草根系，每组试验进行3个技术重复。结果(图3)显示，日本结缕草也在盐胁迫的作用下，出现了表达量升高的现象。在30 min～1 h的增幅较为明显，2 h时出现了较大幅度的升高，到4 h的时候达到了峰值，之后表达量开始下调，尽管48 h的时候表达量下调了很多，但是相比于未进行盐处理的对照(CK)，的表达量依然出现显著性的增加。初步研究表明响应盐胁迫诱导，可能直接或间接参与结缕草耐盐胁迫相关的生物学进程。

3 讨论与结论

日本结缕草是一类耐旱、抗盐的禾本科草坪草类植物，但是对于结缕草耐盐基因功能系统的研究工作较少，在分子生物学调控方面所知甚少。发掘和研究结缕草的抗逆基因有助于理解植物对逆境环境的抗性研究，也有助于结缕草本身的分子育种相关工作。拟南芥是一类耐盐相关的基因，该基因与拟南芥的耐盐性呈现正相关。本研究根据序列相似性原理，从日本结缕草中鉴定出了基因，通过RT-PCR扩增出了该基因的CDS序列，该序列包含有bHLH(cd11455：bHLH_AtAIG1_like)的保守结构域，启动子分析发现了很多典型的转录因子结合结构域，表明该基因参与了体内很多生物学进程。对日本结缕草进行盐胁迫处理，发现该基因响应盐胁迫诱导。植物在受到胁迫后，ROS会出现大量积累，因此ROS相关的基因可能会出现一个激增的现象。在盐胁迫处理30 min～1 h并没有出现一个大幅度的激增，表明该基因可能与植物的ROS途径并无直接的关联。随着盐离子在植物体内的积累，的表达量逐渐升高，在4 h达到了峰值后出现了下降，很可能是因为植物逐渐适应了现有的盐胁迫环境，因此表达逐渐下调。本研究克隆了日本结缕草耐盐基因，为日本结缕草耐盐的分子理论研究提供了思路和参考，也为植物耐盐相关分子育种提供了优质的候选基因。