乳酸菌发酵杨梅果酱工艺优化及其风味成分分析

潘旭婕，刘瑞玲，邓尚贵，吴伟杰，陈杭君，郜海燕，*

(1.浙江海洋大学 食品与医药学院，浙江 舟山 316022；2.浙江省农业科学院 食品科学研究所，农业农村部果品产后处理重点实验室，中国轻工业果蔬保鲜与加工重点实验室，浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室，浙江 杭州 310021)

杨梅()为杨梅科(Myricaeac)杨梅属()植物，是我国的特色水果。我国杨梅种植面积和产量占全球杨梅种植面积和产量的90%以上。杨梅喜温暖湿润，原产于我国东南地区，其中以浙江省的品质最好。杨梅果实酸甜可口，富含多酚、花色苷等生物活性成分。杨梅鲜果无果皮包裹，且多成熟于高温的梅雨季节，贮藏期短且极易腐烂，因此除新鲜食用外，杨梅还多用于加工成果汁、果酒和罐头等产品，发酵杨梅果酱类加工产品，目前在市场上还较为少见。

益生菌(probiotics)是一类可以改善肠道菌群平衡的活性微生物。近年来，有关益生菌发酵果蔬产品的研究逐渐增多。研究发现，通过乳酸菌发酵，可以提高产品的抗氧化活性，分解大分子物质，增加产品风味，还能丰富产品的口感，增加营养功能特性。

近年来，乳酸菌发酵工艺逐渐被应用于脐橙、桑葚等果酱的加工中，以改善产品风味。故优化乳酸菌发酵杨梅果酱工艺条件，并分析发酵对其风味的影响，对杨梅果酱的开发具有一定的现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

东魁杨梅，采自浙江省仙居南峰水果合作社；伊仕特酸奶发酵剂(主要菌种为嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌，活菌数≥1×10CFU·mL)，购自湖北安琪酵母股份有限公司；白砂糖，购于本地联华超市；柠檬酸、异抗坏血酸钠、果胶、卡拉胶(食品级)，购于浙江一诺生物科技有限公司；氯化钠(分析纯)，上海凌峰化学试剂有限公司；苹果酸、柠檬酸、草酸、酒石酸、乳酸、奎尼酸、琥珀酸、富马酸(纯度均大于95%)标准样品，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇(色谱纯)，购自美国泰迪亚公司。

电子天平，余姚市金诺天平仪器有限公司；手持糖度计、恒温培养箱、DK-8D型电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司；DS-1高速组织捣碎仪。Waters e2695分析型高效液相色谱仪(配有自动进样器、二极管阵列紫外检测器)，美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵杨梅果酱工艺流程

杨梅清洗去核护色打浆熬煮白砂糖接种乳酸菌发酵增稠剂(加热浓缩)成品。

挑选无损伤且大小成熟度一致的杨梅，用清水漂洗去核后，于1%柠檬酸与异抗坏血酸钠复配(体积比1∶1)溶液中护色30 min，以质量体积比2∶1加水打浆，备用。熬煮后加入10%白砂糖，冷却后接种1%乳酸菌剂，于37 ℃恒温发酵12 h，加入0.4%增稠剂后于60 ℃加热浓缩，待可溶性固形物含量达到40%后密封装罐。

1.2.2 未发酵杨梅果酱工艺流程

未发酵杨梅果酱除不接种乳酸菌外，其余步骤与发酵果酱一致。

1.2.3 单因素实验设计

以感官评分为指标，对发酵时间、蔗糖添加量、乳酸菌接种量、增稠剂添加量进行初步筛选，每项因素选取5个水平。发酵时间为8、10、12、14、16 h，固定乳酸菌接种量1.0%，发酵温度37 ℃，蔗糖添加量8%；蔗糖添加量为6%、8%、10%、12%、14%，固定乳酸菌接种量1%，发酵温度37 ℃，发酵时间12 h；乳酸菌接种量为0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，固定发酵时间12 h，发酵温度37 ℃，蔗糖添加量8%；增稠剂添加量为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，固定乳酸菌接种量1.0%，发酵时间12 h，发酵温度37 ℃，蔗糖添加量8%。

分别选择柠檬酸、异抗坏血酸钠、柠檬酸复配以抗坏血酸钠(1∶1)、柠檬酸复配氯化钠(1∶1)、异抗坏血酸钠复配氯化钠(1∶1)5种护色剂，添加量均为1.0%，护色时间30 min，以色泽和花色苷含量评价其对乳酸菌发酵杨梅果酱工艺的影响。

1.2.4 响应面试验

根据单因素试验确定乳酸菌发酵条件中的乳酸菌添加量(0.8%、1.0%、1.2%)、发酵时间(8、10、12 h)和蔗糖添加量(8%、10%、12%)这3个因素作为响应面试验中的自变量进行研究，以感官评分作为响应值，根据Box-Behnken中心组合设计原理，进行三因素三水平的响应面分析试验，优化出乳酸菌发酵低糖杨梅果酱的最佳工艺。

1.2.5 杨梅果酱有机酸含量测定

参考关秀杰等的方法，并作修改。采用高效液相色谱法测定果酱8种有机酸含量。

色谱条件：迪马C18反相色谱柱(250 mm × 4.6 mm i.d.)。柱温40 ℃，流动相A为4%乙酸，流动相B为甲醇，等度洗脱[(A)∶(B)=20∶80]，流速1 mL·min。

1.2.6 挥发性风味物质测定

挥发性风味成分萃取：采用SPME-GC-MS测定挥发性风味成分，参考程焕的方法，稍作修改。升温程序为：起始温度60 ℃，保持5 min，以5 ℃·min升到180 ℃，保持1 min，再以10 ℃·min升到240 ℃，保持4 min；进样口温度250 ℃；不分流进样，恒定流速1.5 mL·min。

定性分析：挥发性物质通过NIST MS Search 2.3质谱库中标准物质的图谱对比，采用反匹配度大于800的物质。

定量分析：以邻二氯苯为内标物，采用ROAV法评价杨梅果酱各挥发性成分的贡献度。

1.2.7 感官评价

参照GB/T 22474—2008《果酱》和杨颖等的方法，制定乳酸菌发酵低糖杨梅果酱综合评价标准，感官评价由10位身体健康、具有分辨能力的食品专业学生组成，从口感、风味、色泽、组织状态和酸甜度5个方面对发酵果酱进行评定，去掉一个最高分，去掉一个最低分，取平均值后即为结果。

1.3 数据处理

试验数据采用Excel 2010进行统计分析，用SPSS 23.0统计软件对实验数据进行均方差分析(<0.05)。用Excel 2010进行制图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同种类护色剂对杨梅果酱花色苷含量的影响

花色苷是杨梅果实中的一种天然色素，属于黄酮类化合物，具有抗氧化、抑菌等作用。杨梅的红色主要是由于花色苷的存在，花色苷的含量直接影响杨梅果酱的主要颜色。如图1-A所示，代表明暗度，代表红绿色，代表黄蓝色，用柠檬酸复配异抗坏血酸钠进行护色的果酱的和最大，说明以柠檬酸复配异抗坏血酸钠的果酱最明亮，颜色更接近红色。图1-B以花色苷含量为评价指标，测定经不同护色剂护色30 min后，用柠檬酸复配异抗坏血酸钠进行护色的果酱花色苷含量最高。综上所述，由柠檬酸复配异抗坏血酸钠进行护色的果酱更接近杨梅果实的红色，同时还能保留更多花色苷含量。

图1 不同种类护色剂对杨梅果酱颜色和花色苷含量的影响

2.1.2 发酵条件对杨梅果酱综合感官评分的影响

乳酸菌发酵能够赋予果酱特殊的风味，通过考察乳酸菌添加量、发酵时间和蔗糖添加量3个发酵条件对综合感官评分的影响。如图2-A所示，乳酸菌接种量为1.0%时，综合感官评分最高为80.375分。当乳酸菌添加量在0.6%～1.0%，感官评分随着乳酸菌添加量的增加而上升；当乳酸菌添加量在1.0%～1.4%时，由于发酵产生的酸味掩盖杨梅果酱本身的果香味，导致感官评分显著降低；如图2-B所示，当发酵时间为10 h时，综合感官评分为83.625分。当发酵时间小于10 h时，发酵时间较短，果酱风味单一；当发酵时间大于10 h，发酵时间过长，产生的不良风味掩盖了果酱本身的风味，导致感官评分急剧降低；如图2-C所示，当蔗糖添加量为10%时，综合感官评分最高，为72.857分。外源添加的蔗糖不仅可以作为乳酸菌发酵的原料，促进生长代谢，还可以中和乳酸菌发酵过程中乳酸产生的酸味。当蔗糖添加量小于10%时，无法中和过多酸味，导致口感不佳；当蔗糖添加量高于10%时，蔗糖的甜味掩盖了果酱的风味，口感甜腻，评分降低。

图2 发酵条件对杨梅果酱综合感官评分的影响

2.1.3 增稠剂添加量对杨梅果酱综合感官评分的影响

适量的增稠剂能够增加果酱厚实的口感并形成凝胶状的酱体形态。如图3所示，当增稠剂添加量为0.4%(果胶∶卡拉胶=1∶1)时，综合感官评分最高，为80.375分。增稠剂添加量小于0.4%时，果酱酱体黏稠度不够，有汁液分离、流散现象；当添加量高于0.4%时，果酱酱体黏稠，不易涂抹，且添加量过高时，酱体黏度反倒有所降低，口感硬实，导致感官评分骤降。

图3 增稠剂添加量对杨梅果酱综合感官评分的影响

2.2 响应面优化试验

2.2.1 优化试验结果

利用Design-Expert8.0.6软件对数据进行拟合，得到杨梅果酱发酵工艺感官评分()的多元二次回归方程：

=84+1.88A+0.75B+0.88C+AB-1.25AC+1.5BC-9.13A-1.88B-4.12C。

对模型进行显著性验证检验表明(表1)，该回归模型=149.05，<0.000 1<0.01，模型回归极显著。同时，失拟项=0.702 2>0.05，模型不显著，表示模型预测值与实际值拟合程度高。回归系数=0.994 8，说明模型与试验拟合程度高，可用该模型对发酵杨梅果酱的感官评分进行分析和预测。

表1 回归模型方差分析

如表2所示，蔗糖添加量和发酵时间对感官评分均有显著影响，乳酸菌添加量对感官评分的影响极显著。同时，各因素的交互作用对感官评分均有显著影响。因素值越大，反映出其对试验指标影响越大。通过分析可知，影响杨梅发酵果酱感官评分因素的主次排列顺序为：乳酸菌添加量>发酵时间>蔗糖添加量。

表2 响应面试验方案及结果

2.2.2 因素间的交互作用

响应面曲线是由响应值与任意两个试验因素构成的三维曲面图，可通过每个曲面的弯曲弧度来判断各因素之间的交互作用，弯曲程度越大，说明交互作用越强。等高线则反映了两个因素交互作用的显著程度，越接近圆形交互作用越不明显。图4反映了乳酸菌添加量、发酵时间和蔗糖添加量3个试验因素以感官评分为响应值的曲线图。

由图4可知，A中曲线弯曲程度最大，说明乳酸菌添加量和蔗糖添加量的交互作用极显著，B中曲线最为平缓，表明乳酸菌添加量和发酵时间的交互作用不显著，C中曲线弯曲程度较大，说明蔗糖添加量和发酵时间的交互作用显著。由等高线图可知，图4-A形状更接近椭圆，所以，乳酸菌添加量与蔗糖添加量的交互作用对感官评分的影响最显著(<0.01)。

图4 乳酸菌添加量、蔗糖添加量和发酵时间对杨梅果酱感官评分响应面图

2.2.3 验证试验结果

通过数学模型对乳酸菌发酵低糖杨梅果酱工艺进行优化，分析获得最佳工艺配方为乳酸菌添加量1.02%，蔗糖添加量10.57%，发酵时间10.28 h，预测感官评分最终得分为84.2709分。为便于实际操作，将工艺参数修正为乳酸菌添加量1.0%，蔗糖添加量10.5%，发酵时间10.3 h。在优化条件下，进行3次重复验证试验，感官评价平均得分为81.625分，与模型预测值基本相符，说明该模型与实际情况较为拟合，优化所得的工艺参数合理，具有实用价值。

2.3 不同杨梅果酱有机酸分析

果实中有机酸的组成与含量是影响果实风味品质的重要因素，如表3所示，在检测的8种有机酸中，发酵杨梅果酱相比未发酵杨梅果酱，乳酸含量由6.191 mg·g显著上升至65.481 mg·g(<0.05)，这是因为乳酸菌在发酵过程中产生大量的乳酸。柠檬酸含量也有上升，在糖酵解过程中，乳酸菌能够将葡萄糖转化为丙酮酸，进而通过柠檬酸循环，产生柠檬酸。其中，发酵杨梅果酱的草酸含量虽略高于未发酵杨梅果酱，在检测的7种有机酸中含量最低，对杨梅果酱的风味影响不大。据研究，草酸经人体代谢后的酸性产物，会导致酸碱平衡失衡，过多摄入更会导致中毒。发酵杨梅果酱中的奎宁酸、苹果酸、富马酸和琥珀酸含量相较于未发酵杨梅果酱略有下降，这与申光辉等在桑葚中的研究结果一致，但由于其含量不高，因此对发酵果酱的实际风味影响不大。综上所述，乳酸菌发酵显著增加了杨梅果酱乳酸、柠檬酸的含量，改善了发酵杨梅果酱的品质。

表3 低糖发酵杨梅果酱与新鲜果浆、未发酵果酱有机酸含量比较

2.4 不同杨梅果酱挥发性风味物质分析

使用SPME-GC-MS分别对新鲜杨梅果浆、未发酵杨梅果酱和发酵杨梅果酱的挥发性风味成分进行分析，结果如表4所示：在发酵杨梅果酱中检测出挥发性风味成分共31种，包括酯类2种、酸类3种、烷烃类1种、醛类8种，酮类2种、醇类5种、烯烃类9种、芳香族1种；在未发酵杨梅果酱中检测出挥发性风味成分共29种，其中酸类2种、烷烃类1种、醛类8种、酮类2种、醇类2种、烯烃类13种、芳香族1种；在新鲜杨梅果桨中检测出32种挥发性风味成分，其中酯类4种、烷烃类1种、醛类9种、酮类1种、醇类3种、烯烃类12种、芳香族2种，共计49种挥发性风味成分。

表4 低糖发酵杨梅果酱与新鲜果浆、未发酵果酱挥发性成分及含量

根据计算出的ROAV值，发酵杨梅果酱中的关键挥发性风味成分(ROAV≥1)有3种，分别为(E)-2-庚烯醛、石竹烯和蛇麻烯，起重要修饰作用的挥发性风味成分(0.1≤ROAV<1)有7种，分别为乙酸、己醛、糠醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、辛醛、癸醛和邻苯二甲酸正丁异辛酯；未发酵杨梅果酱中的关键挥发性风味成分(ROAV≥1)有4种，分别为芳樟醇、(E)-2-壬烯醛、十一醛和石竹烯，起重要修饰作用的挥发性风味成分(0.1≤ROAV<1)有7种，分别为己醛、糠醛、辛醛、壬醛、2，6-壬二烯醛、癸醛和蛇麻烯；新鲜杨梅果浆中的关键挥发性风味成分(ROAV≥1)有3种，为芳樟醇、(E)-2-壬烯醛和石竹烯，起重要修饰作用的挥发性风味成分(0.1≤ROAV<1)有4种，壬醛、2，6-壬二烯醛、十一醛和蛇麻烯。石竹烯在2种杨梅果酱与新鲜杨梅果浆中都是检出含量最高的挥发性风味物质，具有木质香和辛香，这与陈亦欣等的研究结果一致。乙酸和芳樟醇也对发酵杨梅果酱的风味具有贡献作用，Kang等鉴定出杨梅中重要的香气化合物有石竹烯、薄荷醇、芳樟醇、乙酸等，但本实验在发酵果酱中检测到的乙酸在新鲜杨梅果浆中并未检测到，猜测是后期加热和乳酸菌发酵过程导致乙酸的产生，芳樟醇则是新鲜杨梅中本就含有的特征风味物质。

与未发酵杨梅果酱和新鲜杨梅果浆相比，发酵杨梅果酱的主要风味贡献成分由(E)-2-壬烯醛转变为(E)-2-庚烯醛，同时糠醛和6-甲基-5-庚烯-2-酮等挥发性物质含量也增多，为杨梅果酱增添了更多木质香、花香和脂香味，与新鲜杨梅果酱相比，未发酵果酱的乙醇含量下降。有关研究表明，添加非酿酒酵母可以减少葡萄酒的酿造过程中产生的不良风味，降低乙醇含量，使香气更复杂。烯烃类物质是杨梅主要的挥发性物质，通过对比发现，发酵杨梅果酱与未发酵杨梅果酱、新鲜杨梅果浆有2种共同的主要风味物质——石竹烯和芳樟醇，是杨梅代表性的挥发性风味物质，虽然石竹烯和芳樟醇的含量经过乳酸菌发酵后降低，但是由于其气味阈值较低，气味活度值较高，对发酵杨梅果酱的风味贡献较大。说明乳酸菌发酵不仅保留了杨梅独特的风味，还为发酵果酱增加了更多的风味，形成其独特的风味。

3 结论

本实验优化出乳酸菌发酵低糖杨梅果酱的最佳工艺配方为：乳酸菌添加量1%，蔗糖添加量10.5%，发酵时间10.3 h，获得的杨梅果酱呈明亮的深红色，具有杨梅和乳酸菌发酵的独特风味，口感醇厚，酸甜适中，具有较好的延展性。乳酸菌发酵不仅增加了果酱中草酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸的含量，尤其是乳酸和柠檬酸(<0.05)从滋味上增加了果酱风味，改善了发酵果酱的口感；还在挥发性风味方面，增加了(E)-2-庚烯醛等醛类物质、酯类物质和醇类物质，为果酱增添了更多木质香、花香和脂香味，不仅保留了杨梅独特的香气，还丰富了果酱整体的风味，开发了一种新型的风味独特的杨梅果酱。