棉纤维起始分化期基因枪介导的GhSuSy表达分析
2022-07-28吕淑芳张红晓胥华伟赵杏利
吕淑芳,张红晓,胥华伟,赵杏利
(河南科技大学 农学院,河南 洛阳 471003)
棉花是世界上重要的纤维作物,棉纤维是纺织纤维的主要来源。棉花胚珠的表皮细胞突起后以极性伸长的方式发育成棉纤维,这一过程中,纤维的起始、伸长和次生壁加厚被大量基因共同调控。棉纤维的主要成分为纤维素。蔗糖合酶作为蔗糖代谢关键酶的一种,可逆地催化糖基转移分解成果糖和葡萄糖,为纤维素的合成提供大量的底物。作为能量代谢和碳源分配的中枢蛋白,蔗糖合酶的活性或相关基因的转录决定了纤维素合成的增加或减少。
通过转基因技术研究纤维素合成中蔗糖合酶介导的调控途径,可挖掘基因功能,揭示棉纤维起始发育的分子机理,但稳定的遗传转化所需时间长,转化效率低且对植物自身生长和繁殖特性要求严格。基因枪瞬时转化表达分析借助于基因枪转化的方法,在活体植物细胞内瞬时建立高效的表达系统,通过仪器对目的基因或蛋白的表达水平进行检测,是一种快速研究蛋白定位与相互关系的方法,在研究启动子功能活性和顺式作用元件的转录活性,以及二者之间的调控功能方面也有作用。基因枪转化技术已经在玉米、水稻、小麦、大豆、棉花等多种作物的研究和育种中得到广泛应用,但基因枪瞬时转化系统的表达效率受多种因素的影响,包裹目的基因的子弹微粒直径、轰击时不同真空度和载体膜压力下子弹的飞行速度等技术参数,以及不同植物、不同组织材料和外植体细胞的生理状态和结构等都会对最终的转化效率产生影响。
本研究借助基因枪瞬时转化技术,探索优化基因枪轰击转化条件,用优化后轰击参数检测了棉纤维起始分化期蔗糖合酶基因偶联的荧光素酶(luciferase,LUC)在叶片与花瓣中的活性,并比较分析相同时期和组织的表达、蔗糖合酶活性,以期建立棉纤维起始过程中基因及其启动子调控的瞬时表达体系,为揭示蔗糖合酶在棉纤维起始分化期的功能与分子调控机理提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
实验材料为陆地棉豫668。因为棉纤维的起始分化时期主要集中于开花前3 d(-3 DPA)到开花后3 d(3 DPA),所测LUC活性、表达、蔗糖合酶活性取样时期为-3 DPA、-1 DPA、0 DPA、1 DPA、2 DPA、3 DPA。优化轰击条件所取叶片为离花铃最近位置叶片,叶片和花瓣都为0 DPA。大肠埃希菌()DH5α、瞬时表达载体p190-LUC和对照载体pPTRL由本实验室保存。
1.2 仪器与试剂
DNA和RNA的提取、PCR纯化试剂盒、内切酶等购自大连宝生物工程有限公司(Takara),质粒大量提取采用北京天根生化科技有限公司(Tiangen)高纯度质粒大提试剂盒(DP116)。金粉、载体膜、爆破膜等相关耗材购自宁波新芝生物科技股份有限公司,基因枪为宁波新芝生物科技公司的高压气体基因枪。双荧光素酶表达和荧光活性检测试剂盒为北京全式金生物技术股份有限公司(TransGen Biotech)的Double-luciferase reporter assay kit(FR201)。荧光素酶活性检测仪器为GloMax2020(Promega,USA)。
1.3 方法
1.3.1 DNA、RNA提取与cDNA第一链合成
DNA提取样品为棉花幼嫩叶片,参照孙志栋等方法,液氮中研磨至粉末后利用CTAB法提取。RNA提取样品为纤维发育6个时期的叶片、花瓣和胚珠,液氮中研磨至粉末后用大连宝生物工程有限公司(Takara)的植物小量RNA提取试剂盒(TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit,9716)提取。所提取RNA经琼脂糖凝胶电泳检测质量和浓度后进行cDNA第一链合成,cDNA第一链合成用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的HiScript Reverse Transcriptase(R101-1)试剂盒合成。
1.3.2 瞬时转化载体构建与质粒DNA的提取
通过CottonFGD查得棉花蔗糖合酶基因(Gh_A05G3937.1)启动子序列(-2 000 bp),在5′端添加dⅢ内切酶,3′端添加HⅠ内切酶,利用一步克隆法设计引物,从基因组DNA中扩增基因启动子片段。所用引物:F: ggatcttccagagatATGTCTCTCCTACTGGACTCAAGTACC,R: ctgccgttcgacgatGAATTTGGATGGTTTAGATGATAGAAGC(引物中小写为重组序列,大写为特异性扩增序列,下划线为酶切位点),引物合成与测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。PCR产物纯化后连接到经Ⅲ和Ⅰ酶切过的p190-LUC载体,然后转化大肠埃希菌()DH5α;挑选阳性菌进行摇菌、提质粒,质粒经PCR扩增与酶切验证后进行测序。
重组质粒DNA采用北京天根生化科技有限公司(Tiangen)高纯度质粒大提试剂盒(DP116)提取,提取后在4 ℃真空离心浓缩仪(FastDry-1,北京蓓迪)浓缩使质粒浓度达到1 000 ng·μL以上备用。
1.3.3 金粉-DNA子弹制备
参照Song等方法略加改变。取金粉60 mg加入1.5 mL离心管,无水乙醇清洗后加入50%甘油1 mL混匀,每管分装50 μL。每管金粉加入约10~15 μg重组质粒DNA和2 μg对照载体pPTRL质粒DNA,振荡混匀。加入40 μL 0.1 mol·L亚精胺溶液,振荡混匀后加入40 μL 2.5 mol·LCaCl溶液,振荡混匀。冰上静置30 min后10 000×离心20 s。75%乙醇漂洗3~5次后,加入80~100 μL无水乙醇重悬,用于基因枪轰击。
1.3.4 基因枪轰击叶片与花瓣
取直径为9 cm培养皿,每皿中放完全浸湿的滤纸2张。叶片和花瓣剪成约1 cm大小,置于培养皿中央,每皿10~12片,放置于基因枪底座上。吸取10~12 μL金粉-DNA子弹滴到载体膜中心,调整压强,设置真空泵真空度为-0.09 MPa,调整培养皿与爆破口的高度轰击,轰击后样品置于22 ℃培养箱避光孵育,孵育时间设为12、16、20、24 h共4个时间。
1.3.5 LUC荧光检测
取轰击后孵育样品加液氮研磨成粉末,依据Double-luciferase reporter assay kit说明书提取检测液,先以荧光素为底物,检测萤火虫荧光素酶在560 nm的报告基因活性,之后在猝灭该荧光的同时,以肠腔素为底物检测海肾荧光素酶在480 nm的报告基因活性。
1.3.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测表达
提取6个时期的叶片和花瓣RNA,检测后经反转录获得cDNA,以7为内参基因,在ABI 7500 realtime PCR system(Bio-Rad,USA)上进行qRT-PCR分析。所用引物见表1。
表1 qRT-PCR所用引物信息
1.3.7 蔗糖合酶活性测定
参照OU-Lee等与高俊凤的实验方法,取0.5 g样品于研钵中,在液氮中研磨成粉末,加HEPES缓冲液充分研磨至匀浆,10 000×离心10 min后取上清(粗酶液)进行测定。酶活性以1 h每g鲜材料产生的蔗糖量(mg·g·h)表示。
1.4 数据分析
所有实验生物学重复3次,采用Origin 9.1软件分析数据并作图。
2 结果与分析
2.1 瞬时转化载体的构建
Plantcare分析结果表明,顺式作用元件集中在基因5′上游2 000 bp。PCR结果(图1-A)显示,从棉花叶片基因组DNA中克隆了启动子。将克隆的启动子序列利用重组酶连接到含35S启动子的p190-LUC报告载体(图1-B),转化大肠埃希菌DH5α。菌液PCR与测序结果表明,克隆的启动子序列与网站上的序列完全一致,说明重组载体p190-LUC-构建成功。
A,GhSuSy启动子片段;B,瞬时表达激活载体。
2.2 基因枪轰击距离和可裂膜压力对转化效率的影响
将重组载体质粒DNA与金粉混合,采用1.3.3节方法制备金粉-DNA子弹。吸取金粉包裹的DNA滴到载体膜中心,将装有棉花叶片的培养皿小心放置于基因枪底座上,真空度设为-0.09 MPa,调整培养皿与爆破口的高度,检测不同距离不同可裂膜压力下轰击后叶片中的LUC荧光。每个样品轰击2次,以未轰击的叶片为阴性对照,仅轰击金粉的叶片为阳性对照,暗中孵育16 h后用发光仪检测LUC荧光,结果见表2。不同压力和轰击距离下阴性对照检测不到荧光,阳性对照在轰击距离为7 cm时检测到微弱荧光。可裂膜压力为6.80 MPa,载体膜到叶片距离为7 cm时轰击叶片,叶片中LUC活性最高,荧光强度为(1.28±0.61)×10,显著高于其他参数轰击时的转化效率。
表2 基因枪轰击参数对LUC表达活性的影响
2.3 轰击次数对叶片和花瓣LUC表达的影响
转化叶片和花瓣结果显示,轰击1次LUC活性较弱,轰击2次LUC活性升高,但轰击3次后LUC活性并没有持续升高,反而还较轰击2次低(图2)。无论轰击2次还是3次,花瓣中LUC活性均明显高于叶片,且二者LUC活性并不随着轰击次数的增加而增加,这说明基因枪瞬时转化棉花叶片和花瓣时轰击2次最佳,且花瓣中LUC的表达比叶片高。
图2 基因枪轰击次数对LUC表达效率的影响
2.4 轰击后孵育时间对LUC表达的影响
如图3所示,叶片和花瓣LUC活性都是呈现先升高后降低的趋势,孵育12 h活性较低,到16 h达到最高,20、24 h迅速降低,并不随着孵育时间的延长而增加,且花瓣中的LUC活性始终高于叶片。这些结果表明,基因枪轰击棉花叶片和花瓣后暗中孵育16 h左右LUC表达最强,棉花发育期瞬时转化系统转化花瓣较转化叶片效率高。
图3 基因枪轰击后孵育时间对LUC活性的影响
2.5 叶片和花瓣的LUC活性
为进一步检测瞬时转化系统在棉花分子调控中的应用,对纤维发育起始时期叶片和花瓣中启动子连接的LUC活性进行了测定和分析。采用优化的基因枪转化条件,用启动子连接的p190-LUC重组载体和p190-LUC本底载体Reference共同轰击-3 DPA、-1 DPA、0 DPA、1 DPA、2 DPA、3 DPA的叶片和花瓣,孵育转化16 h后检测LUC荧光强度。所有样品中本底荧光微弱,报告载体荧光明显(图4),表明转化系统正常。以-3 DPA的叶片LUC活性为对照,在纤维起始的-3 DPA~3 DPA,叶片和花瓣中LUC活性均先升高后降低。叶片中1 DPA的LUC活性最高,接近-3 DPA叶片LUC活性的6倍;花瓣中0 DPA和1 DPA的LUC活性最高,约为-3 DPA叶片LUC活性的9倍(图4)。与叶片中LUC荧光强度相比,花瓣中LUC荧光在纤维发育起始时期都较强,活性高,0 DPA和1 DPA的LUC活性约是叶片的1.5~2.0倍(图4)。这些结果表明,纤维起始时期叶片和花瓣中启动子都被调控,在0 DPA和1 DPA迅速升高,之后下降趋于平缓。
图4 纤维发育起始时期叶片和花瓣的相对LUC活性
2.6 GhSuSy在叶片、花瓣与胚珠中的表达
为了验证基因枪轰击后LUC活性是否与表达一致,进行转录活性分析,实验提取了纤维发育-3 DPA、-1 DPA、0 DPA、1 DPA、2 DPA、3 DPA的叶片、花瓣和胚珠RNA,反转录后利用qRT-PCR检测了6个时期的表达。以7为内参基因,以-3 DPA叶片中表达为对照,qRT-PCR结果如图5所示。在-3 DPA,在叶片、花瓣和胚珠中表达均较低,且无明显差异;-1 DPA~3 DPA,花瓣中表达均较叶片中高,其中,0 DPA表达量最高,此时花瓣中表达量约是叶片的2.7倍。与基因枪轰击后LUC活性相似,叶片和花瓣中表达也是先升高后降低,叶片中在0 DPA和1 DPA表达最高,约为-3 DPA的5倍;花瓣中0 DPA的表达最高,约是-3 DPA叶片表达的13倍。胚珠中表达在-1 DPA开始迅速升高,并在纤维发育时期一直保持较高的表达水平。
图5 纤维发育起始时期叶片、花瓣和胚珠中GhSuSy表达
2.7 叶片、花瓣与胚珠中的蔗糖合酶活性
p190-LUC重组报告载体为目的基因启动子启动的LUC基因表达,但检测荧光为LUC基因编码酶催化的反应,即LUC活性表示目的基因的转录活性。为了更进一步验证基因枪介导的转化在转录分析中的可行性,分别测定了对应6个时期叶片、花瓣和胚珠的蔗糖合酶活性。与LUC荧光强度和表达趋势相似,在0 DPA叶片和花瓣中蔗糖合酶活性都较-3 DPA显著提高,随后叶片中蔗糖合酶活性明显下降;但花瓣蔗糖合酶活性在1 DPA与0 DPA基本一致,没有明显变化,2 DPA后蔗糖合酶活性迅速下降;整个时期花瓣中蔗糖合酶活性较叶片中高(图6)。胚珠中蔗糖合酶活性在-1 DPA开始升高,在0 DPA和1 DPA达到最高,之后开始下降(图6)。这些结果暗示或编码的蔗糖合酶可能参与棉纤维的起始和发育过程。
数据以鲜重计。
3 讨论
分子生物学研究的重心之一为启动子和转录因子对下游相关基因的调控,瞬时转化系统可作为技术手段分析启动子活性、转录因子与DNA的结合能力等调控机制。相对于农杆菌转化和杂交转化等研究方法,基因枪瞬时转化技术研究体系受实验材料的局限性较小,实验周期较短,可短时获得转化材料,可用于基因组研究,是目前研究转录调控蛋白功能和转录调控机制的重要技术之一,但基因枪轰击后的转化效率受实验材料、真空度、微弹速度、轰击次数、孵育时间等多因素的影响。因此,基于基因枪转化技术在不同实验材料的应用参数都有所不同,设置不同条件、不同参数优化转化系统是提高转化效率、成功进行分析的关键。
实验中可裂膜压力为6.80 MPa,载体膜到受体距离为7 cm时轰击叶片,样品中LUC活性最高,明显高于可裂膜压力为4.60 MPa、载体膜到叶片距离为5 cm或可裂膜压力为9.20 MPa、载体膜到叶片距离为9 cm时的转化效率。压力和轰击距离影响微弹的推动力和速度,以及对细胞的伤害程度,几方面协调才能达到最好的转化效果。相对于轰击1次,基因枪轰击2次显示转化效率明显升高,但轰击3次不但没有升高还有所降低,可能和多次轰击后叶片质粒浓度过高、细胞受伤害导致转化效率降低或酶活性丧失相关。许多研究显示,基因枪轰击后样品孵育时间显著影响转化效率。时间太短,DNA在样品中的转化效率不高;时间太长,LUC活性衰减,荧光信号降低。本研究结果显示,棉纤维发育初期轰击叶片和花瓣后孵育16 h左右LUC荧光信号最强。
蔗糖合酶促进棉纤维细胞的分化与伸长,多数研究都集中于纤维中基因表达和蔗糖合酶活性的测定。实验前期结果显示,在纤维细胞起始分化初期,叶片和花瓣中的蔗糖代谢已经发生了显著变化。本研究中,的定量分析与蔗糖合酶活性检测都显示,在0 DPA和1 DPA,叶片和花瓣中基因表达和蔗糖合酶活性都迅速升高,且花瓣中表达高于叶片,推测纤维起始发育时期,在花瓣的表达或编码的蔗糖合酶活性较叶片高。黄圣等对陆地棉15个成员在纤维发育期表达进行分析,结果也显示,15个在叶片中转录本不高,但在花瓣中除外,其他成员的表达量均较高。基因枪转化结果与表达、蔗糖合酶活性结果趋于一致,在0 DPA和1 DPA叶片和花瓣中LUC活性都迅速升高,且花瓣中LUC活性高于叶片,这些结果显示这一时期叶片和花瓣中蔗糖的合成和运输可能介导了纤维的起始分化,同时也表明基因枪介导的瞬时转化可用于后续实验中介导的纤维起始转录调控分析。