ING4、p53、p21、ER、PR与浆液性卵巢癌中 的表达及意义

宿晓晓，李珍，董杏，来梦杰，白忻如，张佩，张威，曾宪旭

(郑州大学第三附属医院病理科，河南 郑州 450000)

0 引言

卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖系统恶性肿瘤中导致女性死亡的主要原因。卵巢癌中最常见的是上皮性卵巢癌，其包括不同的组织学类型，不同的组织学类型来源可能不同[1]。其中，浆液性卵巢癌是最常见的类型。由于缺乏早期筛查的指标及患者对化疗药物的耐药性，约有75%的患者在就诊时已经是卵巢癌晚期[2]，其5年总生存率不到30%[3]。寻找治疗卵巢癌的新的标志物及治疗靶点是有必要的。ING4作为一种候选抑癌基因[4]。研究表明，ING4在细胞凋亡、细胞分化、细胞周期调控、DNA损伤修复及控制细胞衰老中起着重要作用[5,6]。本研究通过检测浆液性卵巢癌中ING4、p53、p21、ER、PR的表达，研究它们在浆液性卵巢癌表达及临床意义，为浆液性卵巢癌的治疗提供临床依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月至2020年3月郑州大学第三附属医院病理科归档的组织蜡块，所选患者年龄37~71岁，平均年龄52岁。其中59例浆液性卵巢癌(A组)，20例交界性浆液性囊腺瘤(B组)，21例浆液性囊腺瘤(C组)；Ⅰ、Ⅱ期32例，Ⅲ、Ⅳ期27例；中、高分化21例，低分化38例；淋巴结转移11例，无转移48例。所有患者均经病理确诊，肝肾功能正常，手术资料完整，未进行放化疗。本研究经郑州大学第三附属医院伦理委员会批准通过[7]。

1.2 试剂

自武汉三鹰公司的ING4多克隆抗体购；购自美国罗氏诊断产品(上海)有限公司的p53、ER、PR多克隆抗体均；购自艾博抗(上海)贸易有限公司的p21多克隆抗体。

1.3 实验方法

1.3.1 组织芯片制作

首先在HE切片上选取具有代表性的浆液性卵巢癌组织，在对应的蜡块标本上标记，选定穿刺点，用穿刺针采集所选组织，按照6×8的序列将其整齐的注入在蜡块列阵中。使用切片机以4μm厚度进行连续切片。

1.3.2 免疫组织化学染色

按上述方法获得组织芯片蜡块，切片并将片子放置在75℃烤箱中60min，然后放入二甲苯溶液中脱蜡，然后依次浸入梯度酒精中脱水，然后用水冲洗，然后将切片置于煮沸的EDTA溶液中修复20min；冷却至室温后放入湿盒中加适量3%H202封闭处理，PBS冲洗。按比例滴加稀释好的一抗，包括ING4(1：600)、p21(1:200)、p53(即用型)、ER(即用型)、PR(即用型)，37℃孵育60min，PBS冲洗。滴加即用型二抗，37℃孵育30min，PBS冲洗。DAB显色，苏木素复染后封片、晾干。

1.4 结果判定

由两位病理科主任医师通过染色评分。双盲法阅片，在高倍镜下(×40)随机选取5个视野进行阳性细胞数统计。评分标准：①根据阳性细胞百分比：阴性0分，1%~10%1分，10%~50%2分，≥50%3分；②根据着色深度：无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。两项得分相加＜3分为阴性，≥3分为阳性[7-9]。

1.5 统计学分析

数据分析应用SPSS 26.0统计软件，计数资料用例数或百分数表示，组间比较应用χ2检验及Fisher确切概率法；应用Spearman 相关分析分析浆液性卵巢癌组织中ING4、p53、p21、ER及PR蛋白之间表达的相关性。若P＜0.05表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同卵巢组织中ING4、p53、p21、ER及PR蛋白的表达情况

免疫组化结果如图1所示。ING4和p53蛋白主要在细胞核中表达、在细胞质及细胞间质中有少量表达，呈棕黄色颗粒。p21、ER、PR蛋白主要在细胞核中表达，呈棕黄色颗粒。ING4蛋白的阳性表达率在C组最高，在B组和A组逐渐降低，且三者之间比较差异有统计学意义(P＜0.05)；A组中p53蛋白的阳性表达率高于B、C两组，且A组同C组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；C组中p21蛋白的阳性表达率高于A组和B组，C组和A组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。ER、PR蛋白的阳性表达率在A组、B组、C组中逐渐升高，且A组与B、C组比较差异有统计学意义(P＜0.05)(见表1)。

图1 ING4、p53 、p21及ER、PR在不同组的表达(SP,×40)

表1 p53、p21、ER、PR和ING4在不同组织中的表达情况[n(%)]

2.2 ING4、p53、p21、ER及PR在浆液性卵巢癌中的表达及与病理特征的关系

p53的表达随着浆液性卵巢癌病理分期增加、分化程度降低和淋巴结转移有上升趋势；p21的表达与浆液性卵巢癌分化程度的降低有升高的趋势；ER的表达与淋巴结转移有关；差异有统计学意义(P＜0.05)。PR的表达与病理分期、分化程度和淋巴结转移无显著相关性；本实验中ING4阳性表达的例数较少，所以ING4阳性表达与临床病理分期、分化程度和淋巴结转移的关系尚不能确定(见表2)。

表2 浆液性卵巢癌组织中ING4、P53、P21、ER、PR的阳性表达及与病理特征的关系[n(%)]

2.3 浆液性卵巢癌中ING4、p53、p21、ER与PR的相关性研究

Pearson相关分析显示：ING4表达与p21表达呈正相关，且差异具有统计学意义(r=0.029，P＜0.05)；p53的表达和p21的表达呈负相关，差异有统计学意义(r=0.137，P＜0.05)；ING4的表达与ER和PR的表达无显著相关性(P＞0.05)(见表3)。

表3 ING4与p53、p21、ER、PR的相关性(r值)

3 讨论

本实验结果表明，ING4蛋白在浆液性卵巢癌组织中的表达较正常卵巢组织相比明显降低，但由于其在浆液性卵巢癌中的阳性表达例数较少，因此ING4蛋白在浆液性卵巢癌组织中的表达与肿瘤临床病理分期、分化程度和淋巴结转移的关系尚不能确定。ING4是一种新型的肿瘤抑制因子，属于II型肿瘤抑制因子家族。现有的研究表明，ING4在乳腺癌[10]，前列腺癌[11]，子宫内膜样癌[12]，宫颈癌[13]等肿瘤中存在缺失，突变或表达下调，表明ING4的表达与肿瘤的发生、发展有关[14-17]。越来越多的研究表明，ING4可以通过诱导细胞周期改变、细胞凋亡及细胞毒性自噬作用，在细胞中以p53依赖或非依赖的方式诱导肿瘤细胞的生长[18,19]。

p53蛋白是一种重要的肿瘤抑制因子，主要参与检测包括细胞周期停滞、DNA修复、细胞衰老、细胞凋亡、细胞分化等多种细胞过程[18,19]。激活p53并且诱导肿瘤细胞凋亡是癌症治疗的一种有效方法。通常50%的人类p53基因发生突变，许多突变型p53蛋白通过多种机制获得促肿瘤作用，而且增加的肿瘤细胞对化疗和放疗的耐药性[20-22]。本实验结果表明，p53的表达随着浆液性卵巢癌病理分期增加、分化程度降低和淋巴结转移有上升的趋势。

p21蛋白属于细胞周期抑制因子，研究表明，p21与肿瘤的增殖、分化、转移及浸润有关，其也可通过抑制细胞周期，促进细胞衰老[23,24]。本实验结果显示：p21的阳性表达率与卵巢癌分化程度的降低有增加的趋势。有研究表明ING4介导的p21上调依赖于ING4与p53之间的直接相互作用，增强p53乙酰化及其转录活性，可上调p21的表达。p21蛋白表达水平升高，使细胞停滞在G1期，从而抑制组织细胞的生长[22][25]。

在内分泌器官中，雌/孕激素受体对预测恶性肿瘤及判断其预后具有重要作用。以往研究表明，雌孕激素受体在卵巢癌中的表达特点及其预后仍存在争议[6-7,26-28]。但在本研究表明，雌孕激素受体的表达情况与浆液性卵巢癌的临床病理特征无显著相关性。

在本研究中，ING4及p21蛋白表达与卵巢癌的发生呈负相关。p53的阳性表达与临床分期、分化程度及淋巴结转移有关。结合以往的相关研究，推测ING4与p53在卵巢恶性转化过程中的相互作用减弱，p21的调节减弱，细胞周期调控丧失，凋亡机制丧失、增殖异常，导致卵巢组织癌变。ING4通过p53和p21途径调控细胞周期，在上皮性卵巢癌中发挥重要作用，联合检测ING4、p53、p21有助于上皮性卵巢癌的早期诊断、精准治疗及预测预后。