非洲猪瘟病毒感染后猪外周血淋巴细胞Toll样受体信号通路的lncRNA-mRNA分析

陈世钰，崔 帅，蒋亚君，鑫 婷，王 洋，郝玉欣，黄建新，郭晓宇，朱鸿飞，吴佳俊，贾 红

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；2.中国动物疫病预防控制中心，北京 102618；3.大理农林职业技术学院，大理 671003)

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病。ASFV是一种核质大DNA病毒，长度介于170～190 kb[1]，共含有150多个开放阅读框(open reading frame，ORF)，其中34个编码结构蛋白，但目前仍有很多蛋白功能未知[2-3]。1921年ASF首次在肯尼亚暴发[4]，随后在撒哈拉以南非洲大部分地区和撒丁岛流行[5]。ASFV在20世纪50年代首次进入欧洲，到1995年从西班牙和葡萄牙彻底根除[6]。2007年欧洲再次暴发疫情，并传播至乌克兰、欧盟东部国家、波兰、俄罗斯等国家[1,7]。2018年中国辽宁首次报道ASF疫情[8]，随后传播至全国，造成巨大的经济损失。ASFV传播方式多样，主要通过易感动物直接接触传播，或污染的猪肉、车辆、人及蜱间接传播[9]。发病动物表现高热、出血和多器官病变，短时间内死亡。试验性感染后7～10 d出现临床症状，可被视为感染晚期[10]。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一种非编码、长度>200 nt的RNA分子，位于细胞核或细胞质中，具有一定功能，可在转录、转录后及表观修饰等多个水平上调节靶基因的表达[11-12]，在细胞增殖、自噬、凋亡及疾病发生发展等多个过程中发挥重要作用。本研究利用高通量测序技术成功构建了猪外周血淋巴细胞的lncRNA文库，通过GO功能和KEGG信号通路富集分析，初步鉴定出影响Toll样受体信号通路的调控网络，为进一步阐述病毒炎症反应和病毒复制等提供了一定理论依据，为ASF的防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物及毒株 10头英系大白猪购自北京市SPF猪育种管理中心，所有猪检测ASFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)及其抗体，结果均为阴性。本试验所用毒株ASFV CADC-HN09株由中国动物疫病预防控制中心提供。试验动物饲养于中国动物疫病预防控制中心P3实验室

1.1.2 主要试剂及仪器 TRIzol®Reagent、Plant RNA Purification Reagent、UNG酶、Qubit 4.0(Invitrogen公司)；TruseqTMSmall RNA sample pre Kit、cBot Truseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS、Novaseq 6000 SBS Kit v3-HS(200 cycles)(Illumina公司)。NanoDrop2000分光光度计(Thermo公司)；琼脂糖(北京全式金生物技术有限公司)；RNA提取试剂盒、lnRcute lncRNA First-Strand cDNA Kit、lnRcute lncRNA qPCR Kit(SYBR Green)、DL2000 DNA Marker(天根生化科技(北京)有限公司)。实时荧光定量PCR仪(型号：ABI 7900HT)。

1.2 方法

1.2.1 试验动物分组及处理 将猪分为试验组(5头)和对照组(5头)，分别接种1 mL 102HAD50的ASFV强毒和等剂量的PBS。于第7天采集前腔静脉血，用淋巴细胞分离试剂盒分离淋巴细胞，细胞样品于-80 ℃保存备用。

1.2.2 RNA提取与质量检测 试验组和对照组各随机选取3个样品进行高通量测序。采用TRIzol法提取样品总RNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测样品完整性，NanoDrop2000分光光度计检测样品浓度与纯度。其中，28S/18S为1.8～2.2，RIN值>7代表提取RNA完整性较好；浓度≥50 ng/μL、总量不低于1 μg即满足建库要求。

1.2.3 测序数据及质量控制 基于边合成边测序(sequencing by synthesis，SBS)技术，采用Illumina 高通量测序平台对cDNA文库进行测序，产出大量的高质量的原始数据(Raw data)，其大部分碱基质量分值能达到或超过Q30。对原始测序数据进行质量过滤，去除测序接头序列、低质量读段、含N比例超过10%的序列及长度过短序列，得到高质量的质控数据(Clean data)。

1.2.4 参考基因组比对分析 质控后的原始数据，即Clean data(reads)，因测序片段是mRNA随机打断的，为确定这些片段由哪些基因转录而来，使用HISAT2数据库将质控后的测序数据比对到猪参考基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=txid9822[Organism:exp])，进而获得用于后续转录本组装、表达量计算等的Mapped data，同时对该次转录组进行测序比对。

1.2.5 lncRNA差异表达分析 获得所有lncRNA表达量后，对表达数据进行统计学分析，进而筛选不同样本之间显著差异的基因。筛选过程以log2|FoldChange|≥1且P<0.05为标准，满足条件的为显著差异lncRNA,并对筛选到的差异lncRNA进行可视化展示。

1.2.6 差异表达lncRNA靶基因预测及富集分析 对差异表达lncRNA采用反式调控(trans法)进行靶基因预测，即当lncRNA与一些距离较远的基因在表达量上存在正相关或负相关的情况时，就可通过样本间lncRNA与蛋白编码基因的表达量相关性分析来预测其靶基因，并对筛选到的差异表达lncRNA进行靶基因GO功能和KEGG信号通路富集分析。

1.2.7 Toll样受体信号通路调控网络 根据GO功能和KEGG信号通路富集分析结果，筛选Toll样受体信号通路，挖掘出调控该通路的内源性lncRNA及相关靶基因。根据差异表达的内源性lncRNA预测其反式调控的靶基因mRNA，初步挖掘调控该通路的lncRNA-mRNA调控网络。

1.2.8 实时荧光定量RT-PCR验证筛选的lncRNA 为确保测序结果的准确性，通过实时荧光定量RT-PCR方法进一步验证所筛选lncRNA。以U6作为内参基因，引物信息见表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反转录及实时荧光定量PCR体系和程序参照试剂盒要求进行。

表1 引物信息

2 结 果

2.1 测序数据

2组样品经过高通量测序后，得到Raw reads，结果见表2。原始文库经过去除低质量和受污染的序列后，获得Raw reads 519 473 712条，Clean reads 504 387 798条，而纯净序列/原始序列集中在92%～98%，说明低质量数据较少，测序效果良好。对照组GC含量在50%左右，而试验组GC含量却维持在56%以上，说明病毒感染导致宿主基因组中GC含量升高。

表2 测序数据统计结果

2.2 比对效率

使用HISAT2数据库对测序数据进行注释并将其定位到猪参考基因组，分析序列在基因组上的分布情况，结果见表3。由表3可知，纯净序列的总体比对率在79%～93%，将其去重后的唯一比对率稍有下降，维持在63%～90%，以上结果表明，仅有少量reads可比对到参考基因组多个位置，多数reads为唯一匹配。

表3 比对率统计

2.3 差异表达的lncRNA

利用高通量测序技术对差异表达的lncRNA进行分析，以log2FoldChange为横坐标、log10FDR为纵坐标对6个样本中的差异lncRNAs绘制火山图(图1)，直观反映了样本间差异表达的分布情况，将上调和下调的显著性差异表达进行统计，结果显示，上调表达lncRNAs 38个，下调表达lncRNAs 35个。

右侧点表示显著上调的基因；左侧点表示显著下调的基因

以样本为横坐标、差异表达基因为纵坐标对差异显著lncRNA进行聚类分析，结果见图2。由图2可知，2组样本间lncRNAs表达差异显著(P<0.05)，试验组与对照组属于不同的分支，说明这2组样本所有基因的表达模式不同。

图2 差异表达lncRNAs聚类热图

2.4 lncRNA靶基因富集分析

2.4.1 GO功能富集 将筛选出来的差异表达的lncRNA进行反式调控靶基因预测，利用GO数据库进行分类，涉及生物过程(biological process,BF)510个条目、细胞组分(cellular component,CC)87个条目、分子功能(molecular function,MF)67个条目。生物过程包括调节免疫系统过程、防御反应、生物刺激、病毒反应和先天性免疫等；细胞组分大多富集在胞内的细胞器和染色体等；分子功能主要富集在蛋白结合、ATP酶调节活性、阴离子结合和腺苷酸结合等。挑选显著富集的前30个绘制气泡图，结果见图3。

每个节点代表一个GO条目术语，代表富集到每个GO 条目中的差异基因；节点的大小与富集到该通路中的差异基因个数成正比

同时对GO富集结果前10个GO条目绘制网络图，其中，调节免疫系统过程、多器官反应、压力应答等过程富集基因最多，且靶基因存在一定的交叉，同时调控多种反应过程，如STAT2参与病毒防御、病毒反应和压力应答等过程，调控病毒感染后的信号转导；IL23R、TRAF3、TNFRSF4、IFNGR1等多种细胞因子相关受体被显著富集到这些条目(图4)。

图4 GO功能富集网络图

2.4.2 KEGG通路富集 选取显著差异的前29条通路绘制柱状图(图5)。结果显示，841条靶基因共富集到332个信号通路上，大部分靶基因与细胞循环、疾病及免疫应答有关，其中细胞循环差异最显著，含127条靶基因，占15.1%，差异显著性依次为p53信号通路、减数分裂等。

图5 KEGG通路功能分析

进一步分析发现，Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、产生IgA的肠道免疫网络(intestinal immune network for IgA production)、甲型H1N1流感(influenza A)等与免疫应答反应、细胞凋亡等过程有关，其中，Toll样受体信号通路在这些通路中被显著富集。

2.5 Toll样受体信号通路调控网络分析

通过差异表达的lncRNA的KEGG信号通路分析发现Toll样受体通路显著富集，该通路共富集到靶基因22个，包括RIPK1、NFKBIA、TRAF3、PIK3CD、LY96、CXCL11、SPP1、MAPK8、IRAK1、IRF7、TLR3、MAP2K6、PIK3CB、TICAM1、TLR1、TLR6、PIK3CA、CCL4、CXCL10、CXCL9、TOLLIP、IFNAR1。lncRNA-ENSSSCG00000041959、lncRNA-ENSSSCG000000 37324、lncRNA-ENSSSCG00000049925、lncRNA-ENSSSCG00000048079共4个lncRNA(后续简写为lncRNA959、lncRNA324、lncRNA925、lncRNA079)是与Toll样受体信号通路相关的差异表达lncRNAs，具体信息见表4。经分析后发现多数靶基因与lncRNA959作用，lncRNA959位于6号染色体(P=0.00879)，预测出lncRNA959通过反式调控靶基因RIPK1、IRAK1的表达，两者与lncRNA靶向调控的正确率分析高达0.97和0.99，初步鉴定出lncRNA959-RIPK1和lncRNA959-IRAK1可能是影响Toll样受体信号通路的lncRNA-mRNA调控网络。

表4 Toll样受体信号通路靶基因

2.6 差异表达lncRNAs的验证

为验证测序结果中获得的差异表达lncRNA结果的可靠性，对Toll样受体信号通路富集到的4个主要基因进行实时荧光定量RT-PCR分析，结果发现RNA-seq与实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)基本一致(图6)，说明测序结果较可靠。

图6 4个差异表达lncRNAs的验证

3 讨 论

ASFV属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，为该科唯一成员。该病毒是唯一的DNA虫媒病毒，只感染猪，家猪和野猪尤为易感，感染后出现严重的临床症状，包括持续高烧、厌食、水样腹泻、皮肤潮红和运动失调等[13-15]。病理学上可见全身器官出血性病变，并伴有白细胞减少症和细胞因子风暴[16]。细胞因子在免疫反应、抗病毒作用等方面有着关键作用，调节先天和获得性免疫反应[17-18]。尽管目前对发病机理的认识不断加深，但ASFV诱发这些变化的具体机制仍有待进一步研究。

新一代高通量测序技术近几年得到快速发展并不断优化，在挖掘和鉴定lncRNA方面表现出巨大的优势。研究发现，非编码RNA在生物活动和病理过程(如病毒感染和肿瘤发生)中发挥重要作用[19]，不仅对猪的各种性状具有调控作用，而且可影响某些疾病的发生发展[12]，尤其是病毒宿主相互作用以及病毒增殖等过程[20]。Hao等[21]检测乙型肝炎病毒(HBV)感染相关lncRNAs的血浆水平发现，AP000253能促进肝癌细胞系中HBV的转录和复制，并可作为HBV感染的潜在生物标志物。Liu等[22]发现了参与调节抗病毒先天免疫反应的lncRNA-Malat1，通过RNA-RBP互作网络靶向TDP43激活来抑制抗病毒先天反应，增加了对先天反应和自身免疫发病机制的分子调控的认识。目前，有关ASFV感染后引起宿主mRNA和miRNA等差异表达谱已有报道，但ASFV感染后引起宿主lncRNA差异表达谱鲜有报道。根据先前的报道，急性ASF试验性感染在接种后7～10 d出现临床症状，可被视为感染晚期[10]。组织病理学评估显示疾病发生典型改变，如巨噬细胞浸润和细胞凋亡，以及ASF感染终末期的细胞因子风暴[23]。同时，本研究在试验过程中也发现在3～5 d开始表现食欲下降等临床症状，7 d左右出现运动障碍、食欲衰退和高热等症状。因此，本试验以ASFV感染7 d后的外周血淋巴细胞为研究对象，利用高通量测序技术成功构建了猪外周血淋巴细胞的lncRNA文库，去除低质量、受污染序列及<25 bp的小片段后，共获得Clean reads 504 387 798条，这些高质量数据不仅丰富了猪的RNA文库，同时为后续研究奠定了一定基础。经进一步统计学分析后得到73个差异表达lncRNAs，聚类热图显示，2组样本的基因表达量差别较大，存在明显的上调、下调。

利用GO数据库，将差异基因按照参与的生物过程、细胞组分、分子功能等分类富集分析，生物过程富集到调节免疫反应过程及先天性免疫，推测这些差异lncRNA可能通过模式识别受体识别特定病原体相关分子模式，启动先天免疫应答反应，从而诱导干扰素的表达。ASFV编码多种免疫逃逸蛋白以逃避宿主天然免疫系统，如MGF360、MGF505能抑制Ⅰ型干扰素(IFN-I)表达，同时抑制产生的抗病毒效应[24]。Jiang等[25]发现lnc-Lsm3b与病毒RNA竞争结合RIG-Ⅰ单体，限制RIG-Ⅰ蛋白的构象变化，阻止下游信号传导，从而终止IFN-Ⅰ的产生。IFN-Ⅰ诱导的lncRNA-ISIR反馈通过去除免疫反应中的抑制性Fli-1来增强IRF3的激活，揭示了lncRNA介导的转录因子激活的调节方法[26]。对于本研究中筛选到的差异lncRNAs调节先天性免疫需进一步验证。

差异表达lncRNAs靶基因的KEGG信号通路富集结果显示,Toll样受体信号通路、TNF信号通路、产生IgA的肠道免疫网络、甲型H1N1流感等通路显著富集。TLRs对病原体的识别通过诱导促炎细胞因子的产生和共刺激分子的上调，引起先天免疫的快速激活。通过MyD88依赖性途径进行TLR信号传导途径，导致促炎细胞因子的产生，并快速激活NF-κB和MAPK。Toll样受体在ASF感染过程中也发挥着重要作用[27]。Henriques等[28]发现一种新的ASFV蛋白pI329L可抑制Toll样受体3(TLR3)信号通路。ASFV编码蛋白A528R通过靶向p65激活和核转位抑制TLR8-NF-κB信号传导。I329L抑制dsRNA刺激的NFκB和IRF3的激活，I329L蛋白的表达也抑制了IFN-β和CCL5的激活。TRIF的过度表达逆转了I329L介导的NFκB和IRF3激活的抑制[29]。Yang等[30]在ASFV感染后的转录水平分析后发现，TLR4和TLR6是RLR途径的负调节因子，在ASFV感染期间呈显著下降趋势，本研究在参与Toll样受体信号通路的lncRNA靶基因中也发现了TLR1、TLR3、TLR6等因子，这表明ASFV感染可能激活了TLR和RLR信号通路。本研究发现，ASFV感染会导致外周血淋巴细胞Toll样受体信号通路显著富集，结合前期报道及研究，ASFV可能通过调控Toll样受体信号通路进而影响宿主免疫炎症反应。

4 结 论

本试验成功运用新一代高通量测序技术筛选出差异表达lncRNAs，并进行GO功能、KEGG通路富集分析，初步鉴定出lncRNA-ENSSSCG00000041959-RIPK1和lncRNA-ENSSSCG00000041959-IRAK1可能是影响Toll样受体信号通路的调控网络。预测lncRNA-ENSSSCG00000041959通过反式调控靶基因RIPK1、IRAK1的表达进而影响Toll样受体信号通路。