紫皮石斛寡糖的酶法制备及单糖组成分析

蒋明星， 易梦镯， 李 翠， 赵云洁， 李 欢， 蔡 胤， 殷根深

(昆明学院 农学与生命科学学院，云南 昆明 650214)

紫皮石斛(DendrobiumdevonianumPaxt.)主产于国家级贫困县——云南省龙陵县，作为国家二级濒危植物，经保护和人工繁育，已经逐步成为当地的新兴特色产业[1]。2018年初云南省卫健委发布了紫皮石斛食品安全地方标准[2]，使之首次获得了食品开发的合法身份，为其进一步开发利用奠定了基础。石斛多糖是石斛的主要成分，与多糖相比，寡糖具有分子量小、黏度低、溶解度高等优势，是理想的新食品原料来源。目前，寡糖在食品保鲜、改善食品品质[3]、低脂食品的加工和制作[4]等方面均有较好的应用。寡糖还可以作为功能因子改善人体肠道菌群[5]、增强免疫力[6-7]、抗氧化[8]、延缓衰老[9]和抑制肥胖[10]等。虽然寡糖的种类较多，但是功能显著的寡糖仍然欠缺，市场上也迫切需要天然来源的多功能性寡糖作为食品新原料。目前，获取寡糖有多种方式，然而从自然界中直接提取的寡糖较为单一，通过化学合成或者化学降解法又容易造成污染，而生物酶转化法具有底物特异性强、水解条件温和、水解过程易于控制、成本低而且环保等诸多优点[11]。目前，对于紫皮石斛功能成分的研究大多集中在石斛多糖，而石斛寡糖的研究鲜有报道，紫皮石斛寡糖的酶法制备还处于初级阶段。与当前研究较多的铁皮石斛相比，紫皮石斛中的石斛多糖平均含量与之相当，而甘露糖的平均含量明显较高[12]。对紫皮石斛多糖的单糖组成分析表明，其主要由甘露糖和葡萄糖组成，还有少量的半乳糖、果糖、木糖和鼠李糖等[13-15]，表明紫皮石斛多糖可能具有更加丰富的结构类型以及更多的生物活性产物。前期工作中获取了大量工业级的紫皮石斛多糖，由于其黏度大，并且含有30%的酒精，难以进行食品添加。本研究拟通过生物酶转化法将其高效制备为紫皮石斛寡糖，通过小试和中试试验验证该方法的可行性，并对单糖组成进行初步分析，为食品新原料的开发提供技术方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 紫皮石斛多糖、魔芋寡糖购自云南与诺生物工程有限责任公司；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)由本试验分离获得。

1.1.2 培养基 ①PDA培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 mL；②发酵培养基：石斛多糖 5 g，(NH4)2SO44 g，蛋白胨 10 g，牛肉膏5 g，KH2PO42 g，MgSO40.5 g，蒸馏水1 000 mL。

1.1.3 主要试剂与仪器设备 Takara BCA Protein Assay Kit(Code No. T9300A，宝生物工程(大连)有限公司)；硅胶板、硅胶(200～300目，青岛海洋化工有限公司)；鼠李糖(分析纯)、核糖(分析纯)、木糖(分析纯)、阿拉伯糖(分析纯)、甘露糖(分析纯)、半乳糖(分析纯)、麦芽二糖(分析纯)、麦芽三糖(分析纯)、麦芽四糖(分析纯)、麦芽六糖(分析纯)，德国 Sigma-Aldrich 公司；葡萄糖(分析纯)，天津市大茂化学试剂厂；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，上海阿达玛斯有限公司。水浴锅(HW.SY11-KP3，北京市长风仪器仪表公司)；磁力搅拌器(C-MAG HS 7 digital，德国IKA)；小型掌上离心机(mini G，德国IKA)；旋涡混合器(MS 3 basic，德国IKA)；立式高压蒸汽灭菌锅(YXQ-50SII，上海博迅实业有限公司)；全波长酶标仪(SpectraMAX 190，美国MD公司)； EYELA冷冻干燥机(FDU-2110，日本东京理化器械株式会社)；高效液相色谱仪(Agilent1100，美国安捷伦科技有限公司)；色谱柱((250 mm×4.6 mm，5 μm)SVEA C18，瑞典Nanologica公司)； PCR仪(GeneAmp PCR System9700,美国赛默飞世尔科技公司)；扫描电镜(S-3400N，日本日立公司)；100 L发酵罐(PV10065，镇江东方生物工程设备技术有限责任公司)；高速离心喷雾干燥机(LPG-10，常州市超群干燥设备有限公司)；纳滤机(有机纳滤膜分子量100 Da，有效膜面积37 m2)(4040，江苏无锡伟尔生化设备厂)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离纯化与鉴定 将石斛多糖提取后的石斛渣上分离到的菌种接种到PDA培养基上，连续划线法挑取单克隆进行纯化培养；CTAB法提取真菌基因组；ITS 扩增引物ITS1-F：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4-R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；通过https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi网站进行序列比对；菌丝体经S-3400N扫描电镜放大300倍进行形态观察。

1.2.2 液态发酵酶液提取、蛋白浓度测定及酶活检测 将活化的粗糙脉孢菌斜面菌种接种至发酵培养基，28 ℃、180 r/min培养3～10 d，发酵液4层纱布过滤，滤液在4 ℃，10 000 r/min条件下离心20 min，上清液即目的酶液。蛋白浓度检测参照Takara BCA Protein Assay Kit(Code No. T9300A)说明书；酶活检测：①对照组：粗酶液沸水浴灭活10 min，取灭活后的粗酶液20 μL与0.5%的石斛多糖溶液480 μL，混匀后45 ℃水浴反应2 h。②实验组：取粗酶液20 μL与0.5%的石斛多糖溶液480 μL，混匀后45 ℃水浴反应2 h。标准曲线制作：称取0.1 g麦芽糖，用蒸馏水配制成10 mg/mL的麦芽糖母液，将母液分别稀释至0.1、0.15、0.2、0.25、0.30、0.35、0.40 mg/mL。分别取7个浓度的麦芽糖溶液500 μL，各加入500 μL的DNS试剂，混匀后沸水浴加热7 min。冷却后取225 μL反应液加入微孔板，酶标仪540 nm处测定吸光度值。根据吸光度值和麦芽糖浓度制作麦芽糖标准曲线。

1.2.3 TLC定性分析 展开剂：V正丁醇∶V冰乙酸∶V水=2∶1∶1；显色剂：将2 mL苯胺、 2 g二苯胺、10 mL 85%磷酸溶于100 mL丙酮中；展开条件：将点好样的硅胶薄层板置于展缸中展开20 min后，取出吹干，二次展开。取出吹干，于显色剂中浸没后取出，吹风机加热至显色。

1.2.4 制备石斛寡糖小试和中试 小试(3 L)：称取石斛多糖1 kg(含30%的酒精)加入PBS(或ddH2O)1.67 L，再加入0.33 L发酵粗酶液。中试(75 L)：在发酵罐中先加入30 L纯净水，预热至45 ℃后，缓慢加入石斛多糖25 kg(含30%酒精)，从顶部分批次加入发酵粗酶液共6 L，再补足剩余的纯净水至总体积75 L，不断从底物放出石斛多糖溶液再从顶部加入，启动搅拌器，转速120 r/min，边水解边混合。

1.2.5 石斛寡糖的浓缩喷干与分离纯化 纳滤时纳滤膜操作压力为1.3 MPa，流量为2 L/min进行浓缩过滤，以除去无机盐、有机酸、硫化物和溶剂等小分子物质，将75 L石斛多糖溶液浓缩至20 L。喷雾干燥机进风温度(130±2) ℃，出风温度(80±2) ℃，进料泵速50 mL/min，将紫皮石斛寡糖浓缩液喷雾干燥。分离纯化采用硅胶柱层析，干法装柱，洗脱剂为V正丁醇∶V冰乙酸∶V水=2∶1∶1；流速1 mL/min，洗脱方式为等度洗脱。

1.2.6 紫皮石斛寡糖单糖组成分析 样品中加入终浓度为1 mol/L HCl，120 ℃水解0.5～1 h (水解液以黄棕色为宜)，调节pH值 4～7待用。待测样品的衍生化标记：取单糖对照品和样品水溶液80 μL，分别置于1.5 mL EP 管中。加入0.25 mol/L 的PMP 甲醇溶液80 μL 和0.3 mol/L 的氢氧化钠溶液80 μL(调pH值为7.0)，涡旋30 s 后70 ℃水浴反应30 min，取出，冷却至室温后，加入0.3 mol/L 的盐酸溶液80 μL 中和(调pH值为4.0～5.0)，涡旋30 s 后用0.5 mL 乙酸异戊酯萃取，涡旋3 min，离心，小心弃去上层有机层，再萃取1 次得下层水层，加0.5 mL 氯仿同法萃取2 次，取上层水层20 μL 进行HPLC 分析。HPLC检测试剂：① A组分：15%乙腈+85%KH2PO4(0.05 mol/L)pH=6.9;②B组分：40%乙腈+60%KH2PO4(0.05 mol/L)pH=6.9。HPLC检测条件：① 0～20 min： A组分80%、B组分20%；② 20～28 min：A组分70%→60%、B组分30%→40%；③ 28～30 min：A组分80%、B组分20%。柱温：30 ℃；波长：250 nm。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化与鉴定

石斛多糖提取后的石斛渣在储藏过程中发现了一株橙黄色丝状真菌，长势良好，有可能具有将石斛多糖转化为石斛寡糖的活性。将该菌株接种于PDA培养基进行纯化培养，提取该菌株的基因组(图1a)，PCR扩增ITS(图1b)后进行测序，通过BLAST比对发现其与粗糙脉孢菌的相似度高达100%，推测其为粗糙脉孢菌。电镜结果显示菌丝较长且疏松，具隔膜、分枝，气生菌丝顶部形成分枝链，着生众多分生孢子 (图1c)，与报道相一致[16]。

图1 粗糙脉孢菌基因组、ITS扩增及扫描电镜下观察Fig.1 Neurospora crassa genome, ITS amplification and observation under scanning electron microscopea：1:DL2000 Marker，2:粗糙脉孢菌基因组；b：1:DL2000 Marker,2:粗糙脉孢菌ITS扩增；c：扫描电镜下放大300倍的粗糙脉孢菌菌丝a：1:DL2000 Marker， 2:Neurospora crassa genome;b：1: DL2000 Marker，2: ITS amplification of Neurospora crassa; c：Neurospora crassa hyphae magnified 300 times under scanning electron microscope

2.2 液态发酵酶液蛋白浓度及酶活检测

实验中定义酶活单位：1 μL酶液、1 min水解得到1 μg还原糖的酶量为一个酶活单位(U)，活力单位为1 U/μL或1 000 U/mL。对不同发酵时间段的蛋白浓度和酶活进行检测，有助于后续对紫皮石斛多糖进行酶转化发酵酶液的选择。

根据BSA标准曲线和麦芽糖标准曲线(图2a和2b)，对不同发酵时间段的蛋白浓度和相应的酶活进行测定，结果显示(图3a)粗糙脉孢菌液态发酵至第7 天蛋白浓度最高，达到1 542.5 μg/mL，其余时间段蛋白浓度也并未出现显著的降低，均维持在1 400 μg/mL左右，可见粗糙脉孢菌从第3天至第10天菌体内蛋白处于持续表达和分泌的状态，这可能跟粗糙脉孢菌中具有丰富的酶系相关。酶活测定结果显示(图3b)第4天酶活最高，达到0.1 U/μL，第3天次之，为0.09 U/μL，5～10 d的酶活相对较低，均维持在0.06～0.08 U/μL之间。蛋白浓度与酶活并未呈现正相关，可能由于水解石斛多糖的甘露聚糖酶并未在蛋白浓度最高时出现最高表达，而是在第4天出现了最高的表达量。

图2 BSA 标准曲线和麦芽糖标准曲线Fig.2 BSA standard curve and maltose standard curve a：BSA标准曲线；b：麦芽糖标准曲线a: BSA standard curve; b: maltose standard curve

图3 不同时间粗糙脉孢菌液态发酵蛋白浓度和酶活Fig.3 Protein concentration and enzyme activity of Neurospora crassa in liquid fermentation at different times a：不同时间粗糙脉孢菌液态发酵蛋白浓度；b：不同时间粗糙脉孢菌液态发酵酶活a: Protein concentration of Neurospora crassa in liquid fermentation at different times; b: Enzyme activity of Neurospora crassa in liquid fermentation at different times

2.3 制备石斛寡糖的小试和中试

工业提取的紫皮石斛多糖中含有30%的酒精，为了验证酒精的存在是否会对酶活产生影响，首先选取粗糙脉孢菌发酵至第4天酶活最高的酶液进行石斛多糖水解为石斛寡糖的小试，分别用PBS或ddH2O配制石斛多糖底物，观察缓冲体系是否会对紫皮石斛多糖的酶解造成影响。结果显示3 h时石斛多糖转化为石斛寡糖较少(图4a)，5 h和7 h时紫皮石斛多糖开始大量被酶解转化(图4b和4c)，24 h石斛多糖基本被转化为石斛寡糖，与魔芋寡糖对照相比基本没有差别(图4d)，表明粗酶液的酶转化效果较好，并且对30%的乙醇具有一定的耐受性。PBS和ddH2O分别配制石斛多糖底物对酶解效果也没有影响。

图4 TLC检测不同时间粗糙脉孢菌发酵酶液水解紫皮石斛多糖Fig.4 TLC detection of hydrolyzed Dendrobium devonianum polysaccharides by the fermentation enzyme liquid of Neurospora crassa a、b、c、d：分别为3、5 、7和24 h TLC检测粗糙脉孢菌发酵酶液水解紫皮石斛多糖；1～4：麦芽二糖、三糖、四糖、六糖标准品；5：未水解石斛多糖；6：PBS溶解的石斛多糖；7：ddH2O溶解的石斛多糖；8：魔芋寡糖a, b, c, d: TLC detection of hydrolyzed Dendrobium devonianum polysaccharides by the fermentation enzyme liquid of Neurospora crassa at 3, 5, 7 and 24 h; 1-4: Standards of maltobiose, maltotriose, maltotetraose and maltohexaose; 5: Unhydrolyzed Dendrobium devonianum polysaccharides; 6: Dendrobium devonianum polysaccharides dissolved in PBS; 7: Dendrobium devonianum polysaccharides dissolved in ddH2O; 8: Konjac oligosaccharides

随后对紫皮石斛多糖的酶转化进行中试，验证试验的可行性。在100 L发酵罐中添加75 L的反应体系，酶转化24 h后取样品进行TLC分析(图5)，结果显示与小试样品相比(Lane 5)，中试的石斛多糖也基本酶解完全(Lane 6)，基本转化为石斛寡糖，与魔芋寡糖(Lane 7)相比，寡糖种类较为丰富。

图5 TLC分析小试和中试紫皮石斛寡糖样品Fig.5 TLC analysis of small-scale and pilot-scale Dendrobium devonianum oligosaccharide samples1～4：麦芽二糖、三糖、四糖、六糖标准品；5：小试样品；6：中试喷干样品；7：魔芋寡糖1-4: Standards of maltobiose, maltotriose, maltotetraose and maltohexaose; 5: Small samples; 6: Pilot spray dried samples; 7: Konjac oligosaccharides

2.4 紫皮石斛寡糖的分离

通过硅胶柱层析色谱对获得的紫皮石斛寡糖样品进行初步的分离，成功获得了二糖至六糖的划段组分，其中组分1得率5.75%，组分2得率5.65%，组分3得率7%，组分4得率4.3%，组分5得率5.6%。通过TLC分析不同组分石斛寡糖的类型，结果显示，组分1(Lane 5)主要为麦芽二糖和三糖；组分2(Lane 6)主要为麦芽三糖和四糖；组分3(Lane 7)主要为麦芽四糖和六糖；组分4(Lane 8)主要为六糖，还有少量的五糖；组分5(Lane 9)主要为六糖(图6)。

图6 TLC分析紫皮石斛寡糖分离的各个组分Fig.6 TLC analysis of the individual components isolated from Dendrobium devonianum oligosaccharides1～4：麦芽二糖、三糖、四糖、六糖标准品；5～9：通过柱色谱分离得到的组分1、组分2、组分3、组分4、组分51-4: Standards of maltobiose, maltotriose, maltotetraose and maltohexaose; 5-9: Component 1, component 2, component 3, component 4, component 5 separated by column chromatography

2.5 石斛寡糖单糖组成分析

为了进一步了解各组分中的单糖组成，以利于后续功能性石斛寡糖的结构鉴定，首先将样品进行酸水解，随后进行PMP衍生标记，通过HPLC鉴定各组分的单糖组成。结果显示(图7)，组分1主要为甘露糖，还有葡萄糖或果糖；组分2至5主要为甘露糖，还有极少量的葡萄糖或果糖。这表明石斛寡糖主要是甘露低聚糖。甘露低聚糖作为新型的寡糖，在调节肠道菌群、抑制肥胖和降低胆固醇等方面[17]均显示出了较好的效果，预示着后续工作中能够发现更多的功能性石斛寡糖。

图7 HPLC分析各个组分的单糖组成Fig.7 HPLC analysis of the monosaccharide composition of each componenta:组分1；b：组分2；c：组分3；d：组分4；e：组分5a: Component 1; b: Component 2; c: Component 3; d: Component 4; e: Component 5

3 讨 论

从石斛多糖提取后的石斛渣上分离得到一株能够酶解石斛多糖的菌株，通过ITS序列和形态鉴定为粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)。对该菌株不同发酵时间段的蛋白含量检测发现其胞外蛋白含量始终较高，这可能与其具有丰富的酶系相关，有报道称该菌株为天然的纤维素快速降解模式菌株，其蛋白的分泌能力与里氏木霉野生型菌株相仿[18]。通过酶转化实验的小试和中试制备了大量的紫皮石斛寡糖，也初步证明了该菌株酶系的丰富性。

单糖组成分析表明，紫皮石斛寡糖主要由甘露糖组成，含有少量的葡萄糖或果糖。在几种常见的六碳糖当中，只有甘露糖能有效的抑制癌细胞的生长[19]，并且甘露寡糖通过重塑肠道菌群，能显著改善轻中度阿尔茨海默症患者的认知损伤[20]。一系列的证据表明，甘露寡糖作为一种新型的功能性低聚糖，在食品新原料开发当中具有显著的优势[21]。因此，将紫皮石斛多糖制备成功能性的低聚糖，将能有效地提高其利用率及附加值。

但是，暂不清楚粗糙脉孢菌中有哪些甘露聚糖酶参与了紫皮石斛多糖的酶转化，其酶学性质也有待研究。后续可以通过单一碳源进行诱导，结合转录组测序分析差异基因的表达，找到关键的甘露聚糖酶基因，异源表达后研究其酶学性质。分离到的紫皮石斛寡糖有何结构特征以及构效关系都有待后续进一步验证。