干白葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量及影响因素调查

阮仕立，王宏安，张杰，刘建勇，李金金，李超，王磊，王根杰，李记明

（1. 烟台张裕葡萄酿酒股份有限公司技术中心/山东省葡萄酒微生物发酵技术重点实验室，山东烟台 264001；2. 陕西丹凤安森曼酒庄有限公司，陕西丹凤 726200）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，简称EC），是大多数发酵食品（如面包、牛奶等）和酒精饮料（啤酒、白酒、葡萄酒等）生产和贮存过程中的一种天然副产物。2007年，国际癌症研究机构将EC的致癌级别由之前的2B类提升认定为2A类。一些主要葡萄酒生产国也相继制定了葡萄酒中EC的限定标准。美国葡萄餐酒中的EC限量为15 μg·L-1，加拿大、韩国和捷克葡萄酒中的EC限量为30 μg·L-1[1]。目前，我国仍未制定葡萄酒中EC的限量标准。近年来，随着我国居民消费水平的提高，葡萄酒的消费量也日益上升，EC作为一种潜在的致癌物质已经逐渐引起社会关注，并成为热门的研究对象。

葡萄酒中EC的形成途径主要有两个：一是尿素与乙醇结合生成，二是瓜氨酸与乙醇结合生成。尿素的主要来源有原料本身所含有的和在酒精发酵过程中精氨酸被微生物降解产生的；瓜氨酸的主要来源有葡萄汁中本身自有的，另外是在葡萄酒酿造后期精氨酸通过苹果酸-乳酸发酵降解而产生的。因此，葡萄酒中EC的形成与尿素、瓜氨酸、精氨酸三种底物的含量密切相关[2-3]。原酒在储存和运输过程中的高温对其中EC的生产有显著影响，随着储存温度的升高和时间的延长，酒中EC含量增长率呈明显上升趋势[4-5]。也有研究表明，脲酶可以降解尿素，从而降低EC的含量[6-7]。本研究主要通过对葡萄原料、发酵原酒和成品酒中EC及其底物（尿素、瓜氨酸、精氨酸）的测定，调查葡萄酒酿造过程中EC生成的影响因素，并提出相应的控制措施。

1 酒样来源及调查方法

1.1 酒样

试材由3部分组成：新疆、宁夏、烟台产区2018年份‘雷司令’‘贵人香’‘霞多丽’原酒19个；国内2014—2018年份成品干白葡萄酒21个；不同国家（产区）的成品干白葡萄酒20个。

1.2 调查方法

1.2.1 样品处理

本试验中EC及底物含量的检测时间为2019年。

（1）新发酵干白原酒中EC含量调查。取2018年新疆（6款‘雷司令’和1款‘霞多丽’）、宁夏（6款‘贵人香’、1款‘霞多丽’）和烟台（5款‘贵人香’）3个产区按正常干白发酵工艺酿造的共计‘雷司令’6款、‘贵人香’11款、‘霞多丽’2款干白原酒样品。在酒精发酵结束进行皮渣分离后在不锈钢罐中静置2周，用深绿色750 mL玻璃瓶取样，橡木塞封口，实验室中常温、避光、卧放储藏，在第3、6、9月时检测原酒中的EC含量。

（2）不同年份成品干白葡萄酒中EC含量调查。取2014—2018年的21个成品干白葡萄酒，常温下贮存，在第3、6个月时取样用于检测追踪其中的EC变化。

（3）不同国家干白葡萄酒中EC含量调查。从市场上购买20款国内外生产的干白葡萄酒，常温避光贮藏，在第0、3、6个月时检测其中的EC，跟踪检测EC含量的变化。

（4）不同产区干白原酒中EC底物的含量差异。对2018年新疆、宁夏和烟台3个产区新发酵的干白原酒进行EC底物（尿素、瓜氨酸、精氨酸）的检测。

（5）贮藏温度对干白葡萄酒中EC的影响。取不同尿素含量水平下的2017年、2018年发酵的干白原酒、和成品干白葡萄酒分别置于5、20、30、40 ℃条件下储存，在第3、6、9个月进行EC检测。

（6）脲酶处理对EC的影响。选择两种脲酶（1#和2#）对2018年新发酵的干白原酒进行处理，添加量均为10 mg·L-1。每种脲酶设4个重复，将酒样置于20 ℃条件下1个月，检测酒样中的尿素和EC含量，以不加脲酶为对照；再将同一酒样放置于40 ℃条件下1个月后，再次检测酒样中的尿素和EC含量。另取一组酒样外加100 mg·L-1尿素，再分别添加10 mg·L-1的上述2个脲酶，以不加脲酶为对照，以同样温度处理后分别在1个月后检测尿素和EC含量。

1.2.2 EC及其底物的检测

尿素的测定按照QB/T 4710—2014（发酵酒中尿素的测定方法 高效液相色谱法）；精氨酸、瓜氨酸的测定参照QB/T 5197—2017（葡萄酒中12种游离氨基酸的测定 高效液相色谱法）；氨基甲酸乙酯按照GB 5009.223—2014（食品安全国家标准—食品中氨基甲酸乙酯的测定）进行测定。

2 结果与分析

2.1 新发酵干白原酒中EC含量情况

检测新发酵干白原酒中EC含量结果表明，3个品种的干白原酒发酵结束后EC含量均小于5 μg·L-1，在室内常温存放6个月后EC未见增加，仍然小于5 μg·L-1。在第9个月时，新疆产区酒样均未有EC检出；烟台的5款‘贵人香’中的4款有EC被检出，含量为8.3～10.20 μg·L-1；宁夏产区6款‘贵人香’中5款有EC检出，最高为27.60 μg·L-1，最低为9.30 μg·L-1，且该区的1款‘霞多丽’EC达到19款酒的最高值，为28.80 μg·L-1。

2.2 不同年份成品干白葡萄酒中EC含量情况

由表1可见，所有干白葡萄酒样品中EC含量普遍较高，这可能与酒中底物含量偏高以及贮藏温度有关。酒龄越长的干白葡萄酒，其EC含量越高。随着贮藏时间的延长，在储藏6个月内，所有的干白葡萄酒中EC含量均呈缓慢增加的趋势。2014—2018年的干白产品其EC增长率（6个月）不同，但酒龄较短的酒（2018年份）的EC增长率更高。

表1 成品干白葡萄酒中EC含量情况Table 1 Content of EC in dry white wine

2.3 不同国家干白葡萄酒中EC含量情况

在不同国家的干白葡萄酒中，大部分样品中可检出EC存在，但含量有所差异。由表2可知，在3次检测中，EC平均含量最高的酒样来自中国，达到16.5 μg·L-1；最低的是西班牙酒，为5.0 μg·L-1。与初始相比，第6个月所有的干白葡萄酒中EC含量都有增加，其中美国的增长率最高，达到74.38%；意大利的增长率最低，为18.97%。

表2 不同国家干白葡萄酒中EC含量Table 2 Contents of EC in dry white wine from different countries

2.4 不同产区干白原酒中EC底物调查

由图1可见，不同产区干白原酒的尿素、瓜氨酸、精氨酸含量差别明显。尿素水平在0.3～62.2 mg·L-1，其中宁夏产区普遍偏高，平均值为31.5 mg·L-1；烟台产区为7.7 mg·L-1；新疆产区最少，平均值为2.5 mg·L-1。瓜氨酸水平在0～204.4 mg·L-1，平均含量新疆产区最高，平均值为67.1 mg·L-1；其次为烟台产区24.5 mg·L-1，宁夏产区最少为21.2 mg·L-1。精氨酸水平在55～1012 mg·L-1，平均含量烟台产区最高，平均值为640.0 mg·L-1；其次为新疆产区440.0 mg·L-1，宁夏产区最少为185.0 mg·L-1。

图1 不同产区干白原酒的尿素、瓜氨酸、精氨酸含量情况Figure 1 Contents of urea, citrulline and arginine in dry white wine from different areas

2.5 储存温度对干白葡萄酒中EC含量的影响

由表3可见，5个样品中温度对EC含量影响的差别非常大，总体表现为随着储存温度的升高和时间的延长，EC含量增长率呈明显上升趋势。如2017年的两个酒样中，5 ℃ 条件下EC增长率较低，为8.73%～11.63%；但40 ℃条件下，EC增长率最高，达到143.88%～339.88%。同时EC增加与尿素含量呈正相关，尿素含量越高，相对应EC含量也越高。但在2018年份样品中，这个规律性不显著，2018年尿素为21.5 mg·L-1的样品中，40 ℃处理时EC含量153.29 mg·L-1低于其他低尿素的3个样品，且尿素为7.5、11.3 mg·L-1的两个酒样在5、20 ℃处理时未检出EC。

表3 不同尿素水平下温度对干白葡萄酒中EC含量的影响Table 3 Effect of temperature on EC content in dry white wine under different urea level

2.6 脲酶处理对EC的影响

由表4可见，两种脲酶处理后的干白葡萄酒中均未检出EC，均能明显降低尿素含量，但2#效果比1#稍差。在高浓度尿素（加100 mg·L-1尿素）存在的情况下，对照样品1个月后EC含量增加至105.8 μg·L-1。而用1#脲酶处理1个月后，尿素降为1.2 mg·L-1，EC未检出。2#脲酶处理1个月后尿素降为10.3 mg·L-1，EC含量为8.5 μg·L-1，约为对照样105.8 μg·L-1的8%。

表4 脲酶处理对干白葡萄酒中尿素和EC含量的影响Table 4 effect of urease treatment on urea and EC content in dry white wine

3 结论

随着贮藏时间的延长，干白中EC含量均呈缓慢增加的趋势。本试验明晰了烟台、宁夏、新疆3个产区干白原酒中尿素、瓜氨酸、精氨酸含量情况，为生产中针对性的控制EC底物含量提供了数据支撑。

温度对EC含量影响很大，随着储存温度的升高和时间的延长，EC含量增长率呈明显上升趋势。调查的4个温度条件下EC含量的增长情况说明，在储藏温度为20 ℃ 条件下，个别样品在储存6个月时EC增长率达到了114.75%，因此，储藏温度不应超过20 ℃。EC含量与尿素底物含量正相关，尿素含量越高，相对应的EC含量越高[8-13]。另外，脲酶处理可以显著降低葡萄酒中尿素含量。

根据本试验研究及国内外其他相关研究，要控制葡萄酒中的EC处于较低水平，首先要严格控制葡萄原料中EC底物水平，尤其是在葡萄生长中后期要严格控制葡萄原料的氮肥使用量，最大限度减少葡萄原料中的氮源[14-15]；其次在发酵过程中，应优先选择产EC较少的酵母，严格控制营养盐的使用，在保证发酵正常情况下，最大限度减少发酵醪中的氮素营养；发酵温度控制在较低的水平；优先选择产EC较少的乳酸菌；尽量不带酵母泥陈酿，原酒澄清过滤后进行陈酿[16-18]；第三，在原酒储藏过程中，改善贮藏环境，尽量低温储藏，低温运输；第四，在出厂环节，严格出厂检验，严控EC及其底物限量，控制在较低水平；最后，在成品酒贮运、销售环节，应对产品贮运环境、仓库温度提出明确要求，尽可能降低运输及储藏温度，温度应不超过（含）20 ℃[19-21]。