‘玫瑰香’葡萄皮游离态和结合态香气成分分析

董经崇，胡文效，邱磊，赵先炎，姚彬彬，程传格，苑金鹏

（1. 齐鲁工业大学（山东省科学院）生物工程学院，山东济南 250353；2. 山东中烟工业有限责任公司技术中心，山东济南 250014；3. 山东省分析测试中心，山东济南 250108）

‘玫瑰香’（Muscat Hamburg）葡萄属于欧亚种，原产英国，由‘黑汉’与‘白玫瑰’杂交育成。果实具有浓郁的玫瑰花香气，生动优雅，是玫瑰香型葡萄代表品种，也是鲜食和加工兼用品种，1892年引入我国，为我国栽培面积较大、分布较广的葡萄品种之一。

香气是评价葡萄和葡萄酒品质的重要指标之一。大量文献显示，葡萄浆果中香气成分以游离态和糖苷结合态的形式存在，并且结合态香气化合物含量高于游离态。王志群等[1]研究发现，‘雷司令’‘赤霞珠’品种中糖苷结合态α-萜品醇含量是游离态的3～5倍，且果实发育过程中没有明显变化。孟楠等[2]在葡萄中确定了许多对葡萄果实香气有重要贡献的C13降异戊二烯类化合物，包括β-紫罗兰酮、β-大马士酮等，它们由类胡萝卜素降解产生；结合态糖基化共轭物的大量积累使得这些降异戊二烯类化合物成为非挥发性的无气味化合物，直到它们在酶或酸水解的作用下被释放为游离态的降异戊二烯类化合物。

葡萄果实中芳香物质的含量分布为果皮＞果肉＞果汁[3]。本研究旨在通过对‘玫瑰香’果皮中不同存在形式的香气成分进行定性、定量分析，为探索‘玫瑰香’葡萄皮资源高值利用和减少碳排放提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：‘玫瑰香’葡萄皮。2021年10月上旬，取自蓬莱国宾酒庄‘玫瑰香’浆果经气囊压榨分离出的果皮。

试剂：氯化钠、无水硫酸钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；乙酸苯乙酯（分析纯），上海麦克林生化科技有限公司；二氯甲烷（色谱纯），美国天地试剂公司；C4～C25正构烷烃（色谱纯），北京化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

多功能粉碎机，永康市红太阳机电有限公司；1031型恒温水浴槽，德国GFL公司；KDM型调温电热套，山东鄄城华鲁电热仪器有限公司；XS104型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；同时蒸馏萃取装置，天长市康鹏实验设备有限公司；旋转蒸发仪，德国海道夫公司；CA-1112型冷却水循环装置，东京理化器械株式会社；7890B/7000D气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

参照王霄倩等[4]对葡萄皮渣的干燥方式。取新鲜葡萄皮渣在常温条件下自然干燥，除去籽，将葡萄皮粉碎至平均粒径0.28 mm后密封放于4 ℃冰箱中，保存待用。

1.3.2 香气成分提取

参照张相辉等[5]对津巴布韦烟叶香气成分的提取方法，经同时蒸馏萃取、旋转蒸发浓缩提取葡萄皮游离态和结合态香气成分。

游离态香气成分萃取：称取10.0 g样品置于1000 mL圆底烧瓶中，加入2.0 g NaCl、200 mL的柠檬酸磷酸盐缓冲溶液（pH 5.5），用电热套进行加热，保持微沸；另取50 mL二氯甲烷置于500 mL圆底烧瓶中，加入0.1 mL内标物（1.0 g·L-1乙酸苯乙酯溶液），用水浴槽进行加热，保持水浴温度为60 ℃，同时蒸馏萃取2.5 h。完成后取出二氯甲烷瓶，向瓶中加入2.0 g无水硫酸钠干燥至少2 h，在50 ℃水浴常压条件下旋转蒸发至1 mL，待进样分析。

结合态香气成分萃取：在样品瓶中加12.0 mL 浓度为3 mol·L-1的H3PO4溶液，调节缓冲溶液的pH值至2.5；另取50 mL二氯甲烷置于500 mL圆底烧瓶中，加入0.1 mL内标物（1.0 g·L-1乙酸苯乙酯），同时蒸馏萃取2.5 h。完成后取出二氯甲烷瓶，向瓶中加入2.0 g无水硫酸钠干燥至少2 h，在50 ℃水浴常压条件下旋转蒸发至1 mL，待进样分析。

1.3.3 GC-MS分析条件

GC条件：DB-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；载气为He；流速1.0 mL·min-1；进样口温度为250 ℃；进样量为1 μL；分流比6∶1；程序升温：初温为50 ℃，保持2 min；再以4 ℃·min-1升到170 ℃，保持5 min；再以8 ℃·min-1升到280 ℃，保持10 min。

MS条件：传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；电磁源EI；离子源EI；电离能70 eV；扫描质量范围30～550 amu；质谱扫描方式：全扫描（SCAN）；溶剂延迟4 min。

1.3.4 定性定量分析

定性分析：参照于立志等[6]定性分析‘巨峰’葡萄香气成分的方法，采用谱库检索结合保留指数（RI）进行鉴定。MS定性：将待定未知物的质谱图在标准谱库（NIST14）匹配检索，保留匹配因子大于80的化合物。RI定性：对C4～C25的正构烷烃标品在相同GC-MS条件下进行分析，根据线性程序升温保留指数公式计算各化合物的RI，并与该化合物在数据库（http://www.odour.org.uk/）中采用相同色谱柱的保留指数进行对比，计算公式：

式中：RT为待测组分的保留时间；RTn、RTn+1分别为待测组分保留时间前后正构烷烃的保留时间；n为正构烷烃的碳原子数。

定量分析：参照刘孟龙等定量分析方法[7]，采用内标定量法计算各组分的含量，计算公式：

1.3.5 香气成分感官属性分析

依据我国著名调香工作者对香料的香气分类[8]，参照文献对香气成分香气特征的描述，结合实际将‘玫瑰香’葡萄皮香气成分按其香气特征归入若干个相应的香韵，每种香气成分可能对应1个或1个以上香韵，每个香韵可包含若干个不同的香气成分。

计算各香气成分的气味活性值（OAV），根据各香韵累计得到的OAV对数值绘制香气轮廓（1种香气成分具有多个香韵时，视其对每个香韵的贡献相同）。OAV是香气成分含量（C）与水中气味阈值（OT）的比值[9]，即：

2 结果与分析

2.1 ‘玫瑰香’葡萄皮游离态和结合态香气成分

‘玫瑰香’葡萄皮游离态和结合态香气成分如表1所示，游离态香气成分77种，结合态香气成分68种。

2.1.1 游离态香气成分

由表1可知，‘玫瑰香’葡萄皮游离态香气成分中，27种萜烯类化合物，5种降异戊二烯类化合物，35种脂肪族类化合物，8种芳香族类化合物，2种其它香气化合物。

27种萜烯类化合物中，萜烯9种（单萜如柠檬烯等3种、倍半萜如β-衣兰烯等6种）；醇12种（单萜烯醇如芳樟醇等8种、倍半萜烯醇如雪松醇等3种、二萜烯醇植醇）；单萜醛2种（柠檬醛、β-环柠檬醛）；单萜酮1种（二氢香芹酮）；醚3种（单萜醚2种：玫瑰醚、橙花醚；二萜醚：泪柏醚）。泪柏醚在葡萄中罕见报道，在‘玫瑰香’葡萄中为首次发现。它们都源于具有C5基本单元的异戊二烯前体异戊烯基二磷酸（IPP）和二甲丙烯基二磷酸（DMAPP），并且通过甲羟戊酸（MVA）与2-甲基赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）两条独立的途径在植物体中产生[10]。单萜、倍半萜及其衍生物（醇、醛、酮、醚）是对葡萄果实香气贡献最大的萜类化合物。

5种降异戊二烯类化合物中6-甲基-5-庚烯-2-酮、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮等源于葡萄类胡萝卜素降解。葡萄进入成熟期游离态和糖基结合态C13降异戊二烯在果实中积累，催化葡萄类胡萝卜素裂解的双加氧酶基因（VvCCD1）的CCD1同源基因已被克隆和鉴定[11]，CCDs能在各种植物类胡萝卜素的特定双键位置发生裂解[12]。

35种脂肪族类化合物中，醛类化合物13种，包括C6、C7、C8、C9、C10醛，其中不饱和醛10种；酸类化合物8种，其中直链脂肪酸6种（长链脂肪酸和中链脂肪酸各3种），支链脂肪酸2种（异戊酸、2-甲基丁酸）；酯类化合物7种，其中脂肪酸乙酯5种（长链脂肪酸乙酯2种，中链脂肪酸乙酯2种和3-羟基丁酸乙酯），乙酸酯1种（乙酸异戊酯）和脂肪酸甲酯1种；内酯类3种（桃醛、当归内酯和β-丁内酯）；酮类2种（3-乙酰基-2-丁酮、3-羟基-2-丁酮）；醇类2种（1-辛烯-3-醇和3,5-辛二烯-2-醇）。脂肪族香气化合物中，醇、醛、酸、酮源于脂肪酸氧化、氨基酸降解，酯类和内酯类是基于醇、酸进一步合成的产物[13]。

8种芳香族类化合物包括苯甲醛、2-苯乙醛2种芳香醛，甲酸香草酯、乙酸苯甲酯2种芳香脂，苯甲醇、2-苯乙醇等3种芳香醇以及1,3,5-三甲氧基苯1种芳香烃。芳香族类化合物大多来源于莽草酸途径的中间体或芳香族氨基酸代谢次生产物。莽草酸途径始于D-赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸的缩合，经过一系列催化反应生成分支酸，分支酸在相关酶的作用下进行色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的合成，其中苯丙氨酸是2-苯乙醇、2-苯乙醛合成的前体物[14]。

2.1.2 结合态香气成分

结合态香气成分是指通过糖苷键与单糖分子结合的香气化合物[15]。由表1可知，‘玫瑰香’葡萄皮结合态香气成分共68种（与游离态共有成分58种），包括25种萜烯类化合物，3种降异戊二烯类化合物，30种脂肪族类化合物，7种芳香族类化合物，3种其它香气化合物。

表1 ‘玫瑰香’葡萄皮游离态和结合态香气成分的组成及含量Table 1 Composition and content of free and combined aroma components in 'Muscat Hamburg' grape skin

续表1

续表1

25种萜烯类化合物中，萜烯11种（单萜如氧化柠檬

烯等5种、倍半萜如β-波旁烯等6种）；醇9种（单萜烯醇如脱氢芳樟醇等6种、倍半萜烯醇α-杜松醇等3种）；单萜醛1种（柠檬醛）；单萜酮1种（二氢香芹酮）；醚3种（单萜醚两种香叶醚、橙花醚和二萜醚泪柏醚）。其中氧化柠檬烯属于柠檬烯氧化物，由顺式和反式结构混合生成，脱氢芳樟醇属于芳樟醇衍生物，可通过分子重排直接合成柠檬醛或制备紫罗兰酮[16]。

3种降异戊二烯类化合物为C13香叶基丙酮、β-紫罗兰酮和植酮，在游离态中均检出（含量相对较高）。

30种脂肪族类化合物包括3,5-辛二烯-2-醇1种脂肪醇，庚醛、2-庚烯醛等7种脂肪醛，正己酸、辛酸等9种脂肪酸，3-羟基丁酸乙酯、β-丁内酯、二氢猕猴桃内酯等11种脂肪酯与内酯，3-乙酰基-2-丁酮、3-羟基-2-丁酮两种脂肪酮。其中辛酸等脂肪酸以C14～C18的游离脂肪酸为前体物质，经过α碳原子羟基化、脱氢、脱羧等一系列途径后生成脂肪醛，随后被氧化成少一个碳原子的脂肪酸[17]。

7种芳香族类化合物包括苯甲醛、2-苯乙醛两种芳香醛，对甲基苯乙酮1种芳香酮，苯甲醇、2-苯乙醇等3种芳香醇以及1,3,5-三甲氧基苯1种芳香烃。

3种其它化合物为5-甲基呋喃醛、糠酸甲酯（游离态不含有）和异戊酸香叶酯，其中糠酸甲酯以糠醛为起始物质，在酸性条件下生成糠酸、进一步酯化反应生成糠酸甲酯[18]，异戊酸香叶酯是异戊酸与香叶醇酯化反应产物。

2.2 游离态与结合态香气成分含量比较

表1显示，‘玫瑰香’葡萄皮游离态和结合态共有的香气成分有58种，其中21种萜烯类、3种降异戊二烯类、26种脂肪族类、6种芳香族类化合物。葡萄皮中化合物的两种存在状态含量如图1。

图1 葡萄皮中香气化合物游离态和结合态形式含量Figure 1 Contents of free and bound forms of aroma compounds in grape skin

萜烯类、芳香族类化合物在结合态形式中的含量较高，脂肪族类化合物结合态形式含量略低于游离态，降异戊二烯类化合物结合态形式含量低于游离态。

葡萄皮中各类香气化合物存在状态及含量与分子官能团类型有关，醇类、酸类、内酯类化合物结合态含量较高。萜烯类化合物中，萜烯醇类化合物结合态形式含量显著高于游离态，芳樟醇、氧化芳樟醇、α-松油醇、橙花醇、雪松醇结合态含量分别是游离态的2.16、14.83、3.95、2.18、1.62倍；脂肪族类化合物中，直链脂肪酸、内酯类化合物结合态形式含量较高，如异戊酸、正癸酸、月桂酸、桃醛结合态形式含量为游离态的3.01、1.35、2.74、1.68倍；芳香族类化合物中，芳香醇、芳香醛化合物结合态形式含量显著高于游离态，2-苯乙醇、2-苯乙醛结合态含量分别是游离态的2.06、3.93倍；降异戊二烯类化合物结合态形式含量较游离态低。

2.3 ‘玫瑰香’葡萄皮香气成分感官属性

香韵（香气特征类型）和香势（香气活度）是香气物质的两个重要感官属性，是评价香气物质香气质与香气量的两个重要参量。对‘玫瑰香’葡萄皮检出的87种香气成分，对照文献报道气味阈值，经计算和统计OAV大于1（对整体香气有贡献）的游离态香气成分33种、游离态加结合态香气成分34种。参照文献对香气成分香气特征的描述，结合实际将OAV＞1的香气成分归入7个香韵类型（花香、青香、木香、果香、甜香、辛香、脂蜡香），如表2。

表2 ‘玫瑰香’葡萄皮中香气成分属性Table 2 Properties of aroma components in 'Muscat Hamburg' grape skin

由表2可知，对葡萄皮香气量有贡献的33种游离态香气成分中，萜烯类12种，占36.36%；降异戊二烯类4种，占12.12%；脂肪族类13种，占39.39%；芳香族类4种，占12.12%。不同类别香气成分对葡萄皮整体香气量贡献度：萜烯类4.38%，降异戊二烯类27.77%，脂肪族类67.60%，芳香族类0.25%。

游离态加结合态香气成分34种，其中萜烯类13种，降异戊二烯类4种，脂肪族类13种，芳香族类4种。假设通过技术手段将葡萄皮结合态香气成分释放出来，并对葡萄皮香气成分进行提取，单位质量葡萄皮提取物OAV较游离态提取物OAV理论上可增加32.62%；预测萜烯类、降异戊二烯类、脂肪族类、芳香族类化合物对提取物整体香气的贡献度分别为7.74%、34.87%、56.49%、0.9%。萜烯类、降异戊二烯类、芳香族类香气成分对整体香气贡献度有大幅度增加，脂肪族类香气成分贡献度有所减少。

表2显示，不同种类香气成分具有各自的香韵特征，每个香韵的强度由多种香气成分贡献。根据表2，把7个香韵作为7个坐标，将每个坐标上香气成分OAV对数值加和，将得到的7个点连线，形成葡萄皮整体香气轮廓，图2。

图2实线显示，‘玫瑰香’葡萄皮游离态香气7个香韵依次为果香＞花香＞青香＞脂蜡香＞木香＞甜香＞辛香，主体香韵为果香、花香、脂蜡香。假设葡萄皮中结合态香气成分通过降解完全释放，依据本项分析结果表1、表2，预测‘玫瑰香’葡萄皮香气或提取物香气轮廓如图2虚线所示，果香＞花香＞青香＞脂蜡香＞木香＞甜香＞辛香，香韵强弱次序与游离态相比虽没发生变化，但整体香气量大幅增加，并且花香、果香、青香、木香是整体香气量增加的主要贡献者，香韵结构比例发生了较大变化，主体香韵为果香、花香、青香。

图2 ‘玫瑰香’葡萄皮中香气成分香气轮廓Figure 2 Aroma profiles of aroma components in Muscat grape skin

3 结论与讨论

通过SDE-GC-MS法对‘玫瑰香’葡萄皮香气成分进行提取和分析，共检测出77种游离态香气成分、68种结合态香气成分，游离态和结合态共有的香气成分有58种，仅以游离态形式存在的化合物有19种，仅以结合态形式存在的化合物有10种。萜烯醇、芳香醇、脂肪酸等化合物结合态形式含量高于游离态，2-苯乙醇、芳樟醇、α-松油醇总体含量最高；C13降异戊二烯类化合物游离态高于结合态。这表明‘玫瑰香’葡萄多数香气化合物以游离态和结合态两种形式存在，醇、酸类化合物主要以结合态形式存在；同时表明，成熟后的‘玫瑰香’葡萄糖苷结合态香气化合物水解酶相对缺失，类胡萝卜素双加氧裂解酶（CCDs）可能仍保持活性。

本研究在‘玫瑰香’葡萄皮中发现“泪柏醚”且含量较高，表明‘玫瑰香’葡萄具有高表达合成泪柏醚合成酶的特性，这为葡萄皮蛋白组学、泪柏醚生物合成研究提供了信息。表1中的5-甲基呋喃醛、糠酸甲酯、异戊酸香叶酯可能是样品前处理过程中化学反应产物。

通过对‘玫瑰香’葡萄皮香气成分感官属性分析，葡萄皮呈果香、花香、青香、脂蜡香，并带有木香、甜香和辛香香韵，33种游离态香气成分对整体香气有贡献，对香气量贡献度大小依次为脂肪族类、降异戊二烯类、萜烯类和芳香族类。‘玫瑰香’葡萄皮结合态香气成分（潜在香气成分）主要是果香、花香和青香香韵的萜烯类和降异戊二烯类化合物。

葡萄酒行业每年生产大量葡萄皮渣[23-24]，目前我国对葡萄皮渣的利用仍停留在简单的粗加工层面，通常被当作肥料、饲料甚至垃圾处理[25]，利用价值低。在葡萄皮渣中，果皮约占皮渣湿重的50%～82%，其中含有多种有机质并具有一定的功能性生物价值[26]，对葡萄果皮进行综合处理利用，可从中提取出花色苷、白藜芦醇、酚酸等酚类物质以及酒石酸，还可对葡萄果皮再次发酵进行醋、酵素的酿造[27]。根据本文研究，‘玫瑰香’葡萄皮中含有丰富的优质香气成分如含氧单萜、倍半萜和C13降异戊二烯等化合物；含有较高浓度的“泪柏醚”生物活性成分，并可能含有双加氧裂解酶（CCDs）有待探索。所以，‘玫瑰香’葡萄皮是一种重要的生物基资源。其作为香气物质资源，将葡萄皮通过酶技术或微生物技术处理，使结合态香气成分充分释放出来[28]，利用现代方法分离出香气物质，应用于食品、化妆品等日用消费品生产，实现葡萄皮高值利用，不但具有经济意义，而且对降低生物碳排放具有重要生态意义。