广西沼泽型水牛瘦素受体基因的克隆及序列分析

毕方方

（广西大学行健文理学院，广西南宁 530005）

瘦素（Leptin）可以提高机体能量代谢效率、增加能量消耗，同时降低动物的食欲、减少体内脂肪沉积，从而减轻体重[1]。Leptin可以直接作用于脂肪组织增强脂肪的代谢，消耗脂肪储备，也直接通过下丘脑调控动物采食量。瘦素是通过其受体（Lepr）发挥调节作用。Tartaglia等[2]首先发现Leptin受体(OB-R)是在小鼠脉络丛内，长度约5.1 kb的单个带状OB-RmRNA。小鼠的OB-R由894个氨基酸残基组成，是一种跨膜受体，由胞外区、跨膜区及胞浆区三部分组成[3]。 Kielar等用分子生物学方法检测到OB-R mRNA在人和啮齿动物的脑、心、胎盘、肝、肾、胰、脾、肌肉、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠、肾上腺中均有表达。目前，尚未有研究广西沼泽型水牛Lepr 基因表达与其生殖功能的相关性的文献报道。本研究通过对广西沼泽型水牛Lepr 基因序列进行克隆，并运用Lasergene软件比对水牛与其他物种的差异，为今后进一步的研究提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

试验所用实验动物来自于南宁肉联厂屠宰的水牛，成年健康且雌雄不限。选取其背部肌肉做样品，将采集到的样品放入冻存管，于-80℃保存，备用。

1.2 主要试剂及仪器设备

TRIzol LS® Regent RNA提取试剂盒购自Invitrogen 公司（美国）；反转录试剂盒、Taq酶、pMD18-T载体以及DNA marker购自Takara生物公司（日本）；质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒购于博日（杭州）；UV-1601型紫外分光光度计购自BioRad公司；175S/00771型凝胶成像分析系统；TD-20/20型荧光光度计购自TURNER DESIGN公司。

1.3 总RNA的提取及cDNA合成

从某屠宰场获取本地水牛背部肌肉，放入1 ml的玻璃匀浆器，并加入液氮水研磨成匀浆，参照Trizol法提取总RNA。DNA 酶处理后1%琼脂糖凝胶电泳检测核糖体 RNA28S 和18S条带的完整性（紫外分光光度计测定波长260 nm 和280 nm 处的OD值1.8～2.0）。经RNA纯度和完整性检测符合试验要求后进行 cDNA合成。以提取的总 RNA为模板，加入抑制剂RNase Inhibitor、Oligo(dT)18 Primer底 物、M-MVL Reverse Transcriptase、dNTP Mixture，42℃ 30 min，95℃ 5 min，5℃ 5 min反转录合成cDNA。

1.4 lepr基因的克隆扩增

根据 NCBI中GenBank报道的水牛Leptin基因序列，设计1对特异性引物，并将序列送大连TaKara公司进行合成。上游引物5'－GTTGAAACTAAGCTTAATTC－3'，下游引物5'－TGGTGGATGAGGCCTTCACTT－3'，所扩增目的片段大小约为522 bp。PCR反应体系（20 µl）:10×taqDNA聚合酶Buffer 5 µl，taqDNA聚合酶1µl，cDNA 2 µl，dNTPmix(10 mmol/L) 2 µl，上下游引物各1 µl，ddH2O 8 μl。

PCR扩增条件为：95℃预变性3 min后， 95℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸40 s，循环30次，最后72℃延伸5 min。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳后，用紫外凝胶成像系统观察并初步鉴定。确定目的条带与预期一致后，利用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，PCR产物回收后与pMD18-T载体连接， 连接产物转化DH5α感受态细胞。将细胞沉淀均匀涂布于LB/平板上，倒置平皿于37℃培养过夜，挑取阳性单菌落于含有Amp+的LB培养基中培养12 h。鉴定结果呈阳性的菌株送上海生工生物科技有限公司测序。

1.5 生物信息学分析

分别使用NCBI blast程序和生物软件Lasergene 7.0对Lepr基因CDS序列进行分子生物学分析，并与GenBank中高同源性动物的Lepr基因CDS序列进行比较，并构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 广西沼泽型水牛Lepr基因PCR扩增

PCR扩增电泳后，在500 bp处附近扩增出一条明显的单一条带，它与预期估计值522 bp接近（图1），可初步推断获得广西沼泽型水牛leptin基因片段。

图1 广西沼泽型水牛Lepr基因PCR扩增

2.2 广西沼泽型水牛Lepr编码区核苷酸序列及氨基酸序列分析

测序结果显示，基因编码区序列长度为522 bp，该核苷酸序列与GenBank中水牛的lepr基因(KU508424)编码区序列的同源性达99.8%，此外，序列分析发现，广西沼泽型水牛lepr基因序列与报道中水牛的相比，在第310位发生碱基突变，但为无意义突变。用MegAlign程序比对广西沼泽型水牛Lepr基因序列与猪、野牛、黄牛、马鹿、绵羊等物种，其序列同源性分别为90.8%、92.6%、92.9%、96.2%、96.1%（图2），其氨基酸序列同源性分别为88.6%、89.9%、97.4%、95.3%、94.4%（图3）。

图2 广西沼泽型水牛Lepr基因 CDS 序列与其他物种同源性分析

图3 广西沼泽型水牛Lepr蛋白氨基酸序列与其他物种同源性分析

用MegAlign程序中Phylogenetic tree对测序所得的广西沼泽型水牛lepr基因核苷酸序列与GenBank发表的其他动物序列进行亲缘分析，结果表明，黄牛、野牛牛与广西沼泽型水牛亲缘关系最接近，与绵羊、马鹿、猪亲缘关系依次变远，与传统生物分类学规律基本保持一致（图4）。

图4 广西沼泽型水牛lepr基因与其他动物的进化树

3 讨论

近年来，随着Leptin基因的功能研究在脂肪代谢、生殖调控、肿瘤、营养代谢病等发面的应用，对其受体分布、基因多样性的研究也快速发展，特别是 Leptin在畜牧生产中生殖调控方面的研究，有助于提高家畜的生产性能，提高经济效益。Yu等研究发现垂体中促性腺激素的分泌是可以通过Leptin的调控促性腺激素释放激素（GnRH）的表达来调控的，如ob/ob小鼠由于体内Leptin表达量不足，促性腺激素分泌减少或其功能损伤，表现为生殖器官萎缩和小鼠不育[4]。ob/ob小鼠的生殖功能的恢复可以通过注射外源Leptin来实现，进一步证明leptin对动物生殖有调控作用。同时Leptin还可以刺激垂体和卵巢分泌LH、PRL和FSH。

有些文献报道，Leptin对生殖有一定得作用，尤其是在胎盘生理发育过程中。在妊娠过程中，Leptin浓度会有所升高，在妊娠的第3个月和妊娠后期Leptin会达到2个峰值，母体分娩后24 h，血浆中Leptin值将会下降到正常值[5]。lepr在卵巢或睾丸中有大量表达，这表明Leptin可对卵巢和睾丸的功能进行调控。分析既往研究发现，Leptin（100 ng/ml）对水牛卵巢颗粒细胞的凋亡有抑制作用，由于滋养层细胞可以局部产生Leptin，在胎盘周边Leptin激素的有效浓度会增大，当滋养层细胞中Leptin的表达受到抑制时会诱导细胞凋亡，这种现象可以通过添加外源Leptin得到恢复。

综上所述，Leptin和lepr基因与水牛的生殖调控有密切的关系。本试验成功克隆了广西沼泽型水牛Lepr 基因编码序列，对水牛Lepr基因的结构和蛋白质氨基酸序列进行了比对，为进一步研究水牛Lepr基因的功能、多样性及表达调控机制提供理论基础。