原料乳中三聚氰胺快速检测高效液相色谱法方法验证

寇永丽，郭 瑞

（大同市综合检验检测中心，山西 大同 037000）

2008 年的“三聚氰胺事件”轰动全国,产生了恶劣的社会影响。三聚氰胺（melamine），化学式为C3N3（NH2）3，被命名为1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺,是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，三聚氰胺分子中含氮量达66.7%,一些不法企业将其添加到牛奶、乳制品中,造成粗蛋白质虚高的假相,不仅对乳制品、养殖业等产业产生不利影响,对人类健康也构成严重威胁[1]。临床试验表明，动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害及肾结石，并可进一步诱发膀胱癌[2]。目前，三聚氰胺已严禁直接用于食品。国家颁布法律法规强调企业在购入生乳原料和原料乳粉及其加工制品时需检测三聚氰胺含量[3-4]。国家质检总局出台了国家标准检测方法：《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T 22388—2008）和《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》（GB/T 22400—2008）。

通过阳性添加回收试验验证《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》（GB/T 22400—2008）的精密度、重复性、回收率、检测限，得出GB/T 22400-2008方法可以快速准确地对生鲜乳中三聚氰胺含量进行检测，适合应用于大批量检测。

1 试验流程

使用方法为《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》（GB/T 22400—2008）。待测样品经乙腈的提取后[5]，经阳离子交换色谱柱分离，经有机滤头过滤后，用高效液相色谱检测，外标法定量。

2 试验方法

2.1 试验试剂与材料

供检测样品为某地区生鲜乳；乙腈（色谱纯），默克化工技术（上海）有限公司生产；磷酸（优级纯），天津市风船化学试剂有限公司生产；磷酸二氢钾（分析纯），国药集团化学试剂有限公司生产；三聚氰胺标准品（纯度≥99%），阿尔塔科技有限公司生产。

磷酸盐缓冲液：准确称取6.8 g（精确至0.01 g）磷酸二氢钾，加入约800 mL 水溶解，用磷酸调节pH 至3.0，定容至1 L，过滤膜抽滤后备用。

2.2 试验仪器

高效液相色谱仪（Waters e2695），沃特斯科技（中国）有限公司生产；多管涡旋振荡器，北京踏锦科技有限公司生产；分析天平（MS303TS），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产。

2.3 标准曲线

称取100 mg（精确至0.1 mg）三聚氰胺标准物质，用水完全溶解后，100 mL 容量瓶中定容至刻度，混匀，即可得到1 000 mg/L 的标准储备液。将1 000 mg/L 的标准储备液用水适当稀释，得到100 mg/L的三聚氰胺标准工作液。

将100 mg/L 的三聚氰胺标准工作液，用水适当稀释后制得浓度为0.005 mg/L、0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L 的三聚氰胺系列标准品溶液。

2.4 仪器参数

2.4.1 色谱柱

SCX 柱，250 mm×4.6 mm（内径），5 μm，安捷伦科技（中国）有限公司。

2.4.2 参数设置

进样量：20 μL；波长：240 nm；柱温：40℃；流速：1 mL/min。

2.4.3 流动相

磷酸盐缓冲液-乙腈（70+30，体积比）。

2.5 具体步骤

称取15 g（精确至0.01 g）生鲜乳试样于50 mL离心管中，加入30 mL 乙腈，剧烈震荡6 min，加水定容至满刻度，充分混匀后静置3 min，用一次性注射器吸取上清液0.22 μm 有机滤头过滤后上机测定。

3 试验结果

3.1 工作曲线

配制浓度为0.005 mg/L、0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L 的三聚氰胺系列标准工作液进行分析，得到2条标准曲线（见图1、图2）：标准曲线（低浓度）、标准曲线（高浓度）。

图1 三聚氰胺低浓度标准工作曲线Fig.1 The standard working curve of low concentration of melamine

图2 三聚氰胺高浓度标准工作曲线Fig.2 The standard working curve of high concentration of melamine

结果表明，三聚氰胺分别在0.005～0.2 mg/L、0.2～50.0 mg/L浓度范围内线性关系良好。线性方程分别为：

3.2 检出限

方法中给出检出限为0.05 mg/kg，进行了6次平行添加试验，结果均可检出，结果见表1。

表1 三聚氰胺方法检出限阳性添加回收试验Tab.1 The melamine method detection limit positive addition recovery

3.3 定量限

取三聚氰胺阴性生鲜乳15 g，加入浓度为10.0 mg/L 的三聚氰胺标准溶液750 μL，获得添加浓度为0.5 mg/kg的待测样品,添加同样的待测样6 个平行，按照2.5 具体步骤样品进行前处理，测定，检测结果见表2，结果表明，三聚氰胺的平均回收率为90.0%，RSD值为1.04%，说明此方法可以对阳性含量为0.5 mg/kg的试样准确定量。

表2 三聚氰胺定量限阳性添加回收试验（n=6）Tab.2 The melamine quantitative limit positive addition recovery test

3.4 精密度

取三聚氰胺阴性生鲜乳15 g，加入浓度为10.0 mg/L 的三聚氰胺标准溶液1.50 mL，获得添加浓度为1.0 mg/kg 的待测样品，添加同样的待测样6 个平行，按照2.5 具体步骤样品进行前处理，测定，检测结果见表3，结果表明，三聚氰胺的平均回收率为96.7%，RSD值为6.16%，精密度良好。

表3 三聚氰胺精密度阳性添加回收试验（n=6）Tab.3 The melamine precision positive addition recovery test

3.5 重复性

表4 三聚氰胺重复性阳性添加回收试验（n=6）Tab.4 The melamine repeated positive addition recovery test

取三聚氰胺阴性生鲜乳15 g，加入浓度为100.0 mg/L 的黄曲霉毒素标准溶液750 μL，获得添加浓度为5.0 mg/kg的待测样品，添加同样的待测样6 个平行，按照2.5 具体步骤样品进行前处理，测定，检测结果见表4，结果表明，三聚氰胺的平均回收率为96.0%，RSD值为6.26%，重复性良好。

4 结论

通过阳性添加回收试验，对《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》（GB/T 22400—2008）进行验证，结果表明，该方法的精密度、重复性良好；在添加浓度为0.5～5 mg/kg时，平均回收率可达到90%以上；阳性添加检测限浓度均可检出；阳性添加定量限浓度均可准确定量。因此，得出GB/T 22400—2008方法可以快速准确地对生鲜乳中三聚氰胺含量进行检测，适合应用于大批量检测。