辅酶A 测定方法综述

2022-07-25刘里，石柔

煤炭与化工 2022年6期

刘里，石柔

（曲靖师范学院化学与环境科学学院，云南曲靖 655011）

0 引言

辅酶A (CoA)是20 世纪50 年代初由德国人Lipmann 和他的同事们发现的。CoA 是广泛存在于动植物体中的天然辅酶，这种小分子(分子量通常≤1 000)以化学方式参与酶催化反应。

CoA 基本结构是由半胱氨酸、泛酸、三磷酸腺苷3 部分组成的。首次从大量猪肝提取物中分离出来的CoA 用于磺胺乙酰化。CoA 是一种在许多酶催化反应中帮助活化和转移酰基的辅因子。由于CoA 上的巯基(-SH)与含有酰基的受体结合形成硫酯，所以可促进细胞体内100 多种化学反应。-SH是赋予其独特的化学/酶学性质的功能位点，它与能量供给、酰基转移、免疫激活，以及许多生物医学反应息息相关。

所有细胞中都能合成的CoA 参与细胞内的许多生化反应，包括氨基酸、碳水化合物和脂类的代谢、肝糖原的储存、乙酰胆碱的合成，以及三羧酸循环。

辅酶A 的浓度能反映出一些常见疾病的病理过程，如糖尿病、癌症和心肌肥大等。由此可见，在生物基质中准确识别和检测辅酶A 浓度的分析方法十分重要。但国内外对其检测技术方面的研究进展至今还未见报道。本文综述了32 年的研究进展，为后续辅酶A 的检测提供一些参考价值。

1 测定方法

由于辅酶A 在生物体内的重要性，需一种灵敏、可靠、快速的分析方法检测其含量。本文从1988 年开始综述测定辅酶A 的各种技术、检测原理以及各种参数。

已报道的测定方法有电化学法、荧光分光光度法、酶反应法、色谱法、毛细管电泳、液质联用仪(LC-MS/MS)和比值比色法。

1.1 电化学法

潜在的低成本和便携性的电分析设备是检测分析的一个极具吸引力的选择。由于电极表面易受其它物质的污染，从而降低了电极的灵敏度和准确度，限制了裸电极的应用。相比之下，基于各种修饰电极的电化学技术，因其固有的简单性、高灵敏度和选择性而受到青睐。

电化学发光(ECL)技术由于其高灵敏度和仪器简单的优点而被广泛应用于许多领域。半导体量子点(QDs)，也被称为纳米晶体(NCs)，由于其独特的尺寸依赖性，引起了人们极大的兴趣。量子点具有尺寸可控、量子产率高、抗降解稳定性好等优良性能，量子点已被用于太阳能电池、药物载体、细胞成像和生化传感器。

在过去的几年里，量子点作为新型ECL 发射器和ECL 传感器得到了广泛的发展。

1.1.1 研究实例一

2015 年，Yufang Hu 等人报道利用核酸模拟配位聚合物优良的电催化活性检测辅酶A 和组蛋白乙酰转移酶的活性。

该研究小组首先以CoA 为有机配体，采用简单的原位合成策略制备了一种新型的仿核酸辅酶A-银离子[CoA-Ag(I)]配位聚合物(CP)，发现其对还原H2O2具有独特的电催化活性。在此基础上，研制了一种新型的无标签电化学传感器，用于检测CoA 和组蛋白乙酰转移酶(HAT)的活性。

Yufang Hu 等人使用这种独特的CoA-Ag(I) CP作为电化学信号探针，高灵敏度和高选择性检测辅酶A 的检测机制分为以下3 步：

（1）由于CoA 分子的两端分别是游离的硫醇基团和腺嘌呤，CoA 可与Ag(I)形成配位聚合物重复单位[(-CoA-Ag(I)-)]，并与沿着主链作为侧基的多个腺嘌呤碱基形成链状结构。因此，如果将CoA-Ag(I)CP 与核酸相比，它们都具有多个碱基侧基，但CoA-Ag(I)CP 用硫醇-Ag(I)CP 主干取代原来的戊糖/磷酸核酸主干。因此，在某种程度上，CoA-Ag(I) CP 在结构上与聚A 单链核酸(ssNA)相似，所以，命名为模拟核酸CP。

（2）受ssNA 与氧化石墨烯(GO)等二维碳纳米材料强选择性相互作用的启发，发现CoA-Ag(I)CP与ssNA 类似，也可以通过侧链的腺嘌呤通过π-π堆积作用轻松并有效地与GO 结合。

（3）实验进一步证明了GO 修饰电极吸附的CoA-Ag(I)CP 对H2O2的还原具有较高的电催化活性。电流与CoA 的浓度呈良好的线性关系，线性范围为0.1~100 μM，检出限为0.05 μM(S/N=3)。实际样为添加了CoA 的人血清，加标回收为96.7%~108.5%。

1.1.2 研究实例二

2018 年，Zhao 等人发现了一种超灵敏测定辅酶A 的光电化学方法。辅酶A 作为电子供体加入到纳米CdSe/ZnO 光电极的光电化学反应中，建立了一种新的光电化学(PEC)体系。

PEC 分析利用光来激发光电活性物质，被激发的物质与电子给体/受体发生反应产生光电流。因此，PEC 方法的灵敏度受电极、光电材料、电子给体或受体类型等多种因素的影响。

与电化学方法相比，PEC 可以消除一些不需要的背景信号，与光催化过程相似，产生的光电流能大大提高该方法的灵敏度。

一方面，CdSe 量子点是一种介于宏观和微观结构之间的亚稳态半导体材料，具有吸收光谱宽、稳定性好、比表面积大等优点，已被用于制备PEC传感器。另一方面，CysH 和CoASH 都是含有巯基(-SH)的化合物，可以作为电子给体进行电子转移反应，并且可以抑制光敏半导体纳米材料的光激发电子空穴对的复合，产生光电效应。

在ZnO 纳米棒阵列表面覆盖CdSe 量子点，制备了CdSe/ZnO 光电极。CdSe/ZnO 光电极作为光敏界面，以其光敏性和作为电子受体的特性，与CysH 或CoASH 形成了一个PEC 体系，为CysH 和CoASH 的分析提供了一种新的PEC 方法。

在20 mW/cm2，410 nm 可见光照射下，得到了偏置电压为0 V 时半胱氨酸或辅酶A 对光电流的敏感响应。优化实验条件后，光电流与辅酶A 浓度的对数成正比，线性范围为2.00×10-2~ 50.0 μmol/L，辅酶A 的检出限为1.00×10-2μmol/L(S/N=3)。其它氨基酸或常见辅酶不干扰半胱氨酸和辅酶A 的测定。

1.1.3 研究实例三

2018 年，Chen 等人研究了一种CoA- 银配位络合物(CoA-Ag)，它能加速H2O2分解，提高CdTe@CdS QDs 的阴极ECL 强度。

辅酶A 是代谢过程中必不可少的辅酶，由腺苷3’-磷酸和一个巯基组成。因此，CoA 被认为是一种与贵金属(如银、金、铜)离子反应能力强的巯基官能团化合物。鉴于上述原理，2 个官能团巯基和腺嘌呤连接的分子CoA-Ag 络合物，是由大量巯基-Ag 重复单位，像类似的多聚腺苷酸RNA 链组成的。

为了验证CoA-Ag 复合物的RNA 结构，Chen等人研究了合成的CoA-Ag 络合物是否可以用荧光法与SGII 结合，因为SGII 荧光染料可以特异性染色单链核酸。

研究结果表明，与SGII 结合CoA-Ag 络合物具有明显的放大信号发射，而单一的CoA-Ag 络合物或SGII 荧光不明显，事实证明CoA-Ag 具有RNA 结构。

单链核酸很容易通过π-π 和分子间作用力吸附在石墨烯或氧化石墨烯(GO)表面。由于CoA-Ag络合物与RNA 类似，所以，GO 表面对CoA-Ag 也有高吸附能力。此外，GO 负载CoA-Ag 的量随着CoA-Ag 络合物的量增加而增加。

CdTe@CdS QDs 是一种阴极ECL 发射纳米材料，在CdTe@CdS QDs-ECL 体系中引入了CoA-Ag络合物，研究其电化学行为和ECL 行为。CdTe@CdS QDs 表现出ECL 最大波长在607 nm，与荧光发射光谱相当，表明阴极ECL 信号来源于CdTe@CdS QDs 激发态(CdTe@CdS*)。在CoA-Ag 存在时，CdTe@CdS QDs 在607 nm 表现出相同的最大波长，表明CoA-Ag 只是放大了CdTe@CdS* 的数量，而不会改变CdTe@CdS QDs 的其它属性。

Chen 等人推测CoA-Ag 络合物加速了电极表面的电子转移，增加了CdTe@CdS*的数量，最终增强了ECL 信号。在负电位方向扫描时，通过电荷注入将共反应物H2O2还原为羟基自由(·OH)，将CdTe@CdS QDs 还原为纳米晶CdTe@CdS(e-)。随后，·OH 与带负电荷的CdTe@CdS(e-)发生反应，直接氧化CdTe@CdS QDs，同时发出光，产生激发态CdTe@CdS*。

ECL 信号随着CoA 浓度在0.1~100 μM 范围内增加而增加，这是由于增加了CoA-Ag 络合物的数量。根据不同浓度CoA 下的ECL 的强度，ECL信号与CoA 浓度之间存在线性关系。线性方程为I-I0/I0= 0.082 0C+ 0.211(I0表示了最初的ECL 强度，I表示CoA-Ag 增加的ECL 强度)，检出限(LOD)为0.03 μM(S/N=3)。

为了进一步探索传感在生物样品中的应用，在反应体系中加入10%的血清，用该方法测出的含量与CoA 分析试剂盒测得的含量进行比较，获得令人满意的数据。

电化学发光(ECL)结合电化学和光学技术，具有操作简单、响应快、低背景、高灵敏度和低仪器要求等优点，但是它的实验过程复杂。

1.2 荧光分光光度法

荧光光谱法以其灵敏度高、选择性好、检出限低、简便易行等优点，从而被广泛应用于辅酶A的检测。

1.2.1 研究实例一

2007 年，Qian 等人在pH=6.80 缓冲溶液中使用铕(Eu3+)-四环素(TC)络合物作为荧光探针，辅酶A 可显著提高添加H5IO6后Eu3+-TC 络合物在λ =612 nm 的荧光强度，增强的荧光强度与辅酶A 的浓度成正比。

在CoA-H5IO6-buffer-Eu3+-TC 系统中，当H5IO6为3.59×10-5~6.46×10-5mol/L 时，ΔF达到最大并保持不变。在最佳实验条件下，增强荧光值（ΔF）和辅酶A 的浓度之间有一个很好的线性关系，线性范围为6.08×10-8~ 1.84×10-5mol/L，检出限为4.62×10-8mol/L。实际样选用了成都天台山药业有限公司注射用辅酶A、人血清和猪肝，实验结果准确。

1.2.2 研究实例二

2007 年，Li 等人建立了一种测定微量辅酶A(CoA)的荧光分光光度法。在pH=5.4 的缓冲溶液中，当高碘酸(H5IO6)存在时，CoA 可以显著增强添Tb3+- 环丙沙星(CIP)络合物在545 nm 处的荧光强度，Tb3+离子的增强荧光强度与CoA 的浓度成正比。测定CoA 的线性范围和检出限分别为6.08×10-6~1.64×10-5和2.1×10-8mol/L。

Li 等人选择CIP 作为Tb3+的配体，并研究了在H5IO6存在的情况下，CoA 作为协同配体对Tb3+荧光有增强作用。在335 nm 处激发后，在545 nm处测量荧光强度。检测机理推测为CIP 可以与Tb3+离子形成稳定的二元络合物，在490 和545 nm 处观察到Tb3+离子的特征峰，分别来自于Tb3+离子的5D4-7F6和5D4-7F5跃迁。

加入H5IO6后，(Tb3+-CIP)*的荧光强度明显降低。H5IO6-(Tb3+-CIP)*-CoA 体系的荧光光谱与H5IO6-(Tb3+-CIP)*相似。但在CoA 作用下，H5IO6-(Tb3+-CIP)*的荧光强度明显增强，Tb3+离子的荧光强度增强与CoA 浓度成正比，说明在H5IO6作用下，CoA 可以与(Tb3+-CIP)*络合物形成非常稳定的三元复合物。

但在没有H5IO6的情况下，添加CoA 后Tb3+-CIP 体系的荧光强度变化不大。在H5IO6存在的情况下，pH 值对(Tb3+-CIP)* 和(Tb3+-CIP)*-CoA 体系的荧光强度有显著影响。H5IO6-(Tb3+-CIP)*CoA(F)和H5IO6-(Tb3+-CIP)*(F0)体系的荧光强度随pH 值的变化而变化。实验结果表明，在pH=5.4 时，ΔF(F-F0)达到最大值。

随着H5IO6的加入量的增加(从0.1 mL 到0.7 mL)，(Tb3+-CIP)*(F0)的荧光强度开始急剧下降，而CoA-(Tb3+-CIP)*(F)的荧光强度变化不大。当H5IO6加入量＞1.5 mL 时，F明显降低，F0变化不大。因此，选择1.0 mL H5IO6(浓度为5.3 ×10-5mol/L)时，F0明显下降，F保持恒定，ΔF值大大增强。

在H5IO6存在的情况下，反应时间对(Tb3+-CIP)*和(Tb3+-CIP)*-CoA 体系的荧光强度有影响。螯合反应在室温下20 min 内完成，荧光强度达到最高值，并保持至少180 min。因此，所有螯合反应均在室温下进行30 min，所有测量均在室温下3 h 内完成。

实际样选择了由安徽丰元药业有限公司生产的注射用辅酶A，并用酶法进行了对照；猪肝样品用加标回收实验来验证方法的准确度，实验结果令人满意。

1.2.3 研究实例三

近年来，杂原子掺杂被认为是改善CDs 光学性质和提高CDs 量子产率(QY)的一种有前途的方法。特别是氮(N)原子由于与碳原子大小相似，可以与碳原子发生强烈的结合，因此，N- 掺杂的CDs(N/CDs)具有更高的荧光量子产率(QYs)。

而硫(S)原子可以调节态密度，提供发射陷阱态(ETSs)，这导致电子被激发来修正带隙能。因此，S 掺杂可以使CDs 的最大荧光发射波长变长，提高CDs 的荧光强度。

2017 年，Hu 等人提出了一种S 和N 共掺杂荧光碳点(S,N/CDs)的制备方法。该方法以2 种天然物质(菱角和洋葱)为前体，通过对菱角和洋葱的水加热，得到了单分散、高荧光的S,N/CDs(直径约为3.5 nm)。S,N/CDs 表面的羧基可以与Cu(II)离子结合，导致S,N/CDs 的发光猝灭，而辅酶A (CoA)可以恢复(S,N/CDs)的发光，基于S,N/CDs 上述的特性，提出了一种新颖的荧光探针以用于CoA 高灵敏度的测定。

在最佳条件下，线性范围和检出限分别是0.03~40 μM 和0.01 μM。S 和N 被用作杂原子来合成S 和N 共掺杂的CDs (S,N/CDs)，S,N/CDs-Cu(II)作为荧光探针检测CoA 时的荧光机制。

S,N/CDs 在370 nm 光激发下发射出很强的蓝绿色荧光，加入Cu(II)离子后，蓝绿色荧光明显减弱。这一结果验证了Cu(II)离子可以猝灭S,N/CDs 的发光，因为Cu(II)离子很容易与S,N/CDs 表面的羧基和羟基螯合，形成无辐射络合物[(S,N/CDs-Cu(II)]。无辐射络合物的形成，改变了S,N/CDs 表面的缺陷和激子分布，导致了荧光猝灭，使发光达到“关闭”状态。

加入CoA 后，Cu(II)离子从S,N/CDs-Cu(II)络合物中分离出来，CoA 分子中的硫醇基团与Cu(II)离子发生强烈结合，形成更稳定的Cu(II)键，使S,N/CDs 的发光恢复到“打开”状态。

为进一步证实上述猝灭机制，检测了不同浓度Cu(II)离子存在时S,N/CDs 的荧光寿命。加入猝灭剂后，如果荧光寿命降低，则为动态猝灭；如果荧光寿命不变(τ0/τ=1)，该系统是静态猝灭。

实验结果表明，荧光寿命发生了微小变化，说明Cu(II)猝灭S,N/CDs 荧光是一个静态猝灭过程，因为它形成了一个稳定的无辐射络合物。

随着CoA 浓度的增加，S,N/CDs 的荧光信号逐渐恢复。体系的荧光强度的增强值与辅酶A 浓度显示了良好的线性关系，线性范围为0.03~40 μM，检测限为0.01 μM。实际样为猪肝，加入的标准为1.50×10-7mol/g，回收为3.00×10-7mol/g，回收率为102.2%，相对标准偏差为2.4%。

该法的最大特点是在加入添加铜(II)离子后，荧光信号逐渐减少，在约6 min 时达成平衡，6 min后保持不变，猝灭荧光时间令人满意。在S,N/CDs-Cu(II)中加入辅酶A 后，荧光迅速在1 min后恢复，反应时间非常短，但线性范围较窄。

迄今为止，各种荧光探针，如荧光染料、荧光蛋白、荧光无机或有机纳米颗粒，已经成功开发和应用。在制备的荧光探针中，如碳点(CDs)，是一种新型的零维碳纳米材料，因其制备简单、独特的光学性质和高耐光性、低生物毒性和优良的生物相容性等独特优点，而受到了广泛的关注。

1.2.4 研究实例四

2020 年，Long 等人设计了一种新型的白胡椒衍生比率型碳点(CDs)，量子产率为10.4%，作为高校特异检测CoA 的荧光纳米传感器。

首先，将16 种金属离子(40 μM)分别添加到CDs 溶液中，只有当Cu2+加入后，CDs 的原始荧光强度在520 nm 处猝灭。当Cu2+的浓度从0 逐渐增加到65 μM 时，CDs 的荧光强度在520 nm 逐渐下降；当Cu2+的浓度从65 μM 不断增加到80 μM 时，CDs 的荧光强度并没有发生明显的减少，同时，最大发射波长发生蓝移。

添加Cu2+(65 μM)进入CDs 溶液(2.0 mg/mL)中，最大紫外吸收波长(261、310 和343 nm)没有变化，吸收强度降低，而荧光寿命从4.31 ns 降低到4.19 ns。猝灭机理推测为CDs 表面基团(如-COOH、-OH、-NH2)与Cu2+之间存在亲和作用而发生静电相互作用，无辐射电子转移进而导致荧光猝灭。辅酶A含有巯基、磷酸基和氨基，由于其易与Cu2+结合形成更稳定的络合物，迫使Cu2+从CDs 中分出来，此时CDs 表面不再含有Cu2+，CDs 的荧光得到恢复。

与预期一样，Long 等人观察到在CDs-Cu2+溶液中加入CoA 后，荧光强度和荧光寿命得到恢复。生物硫醇(如Hcy、GSH、Cys)也有硫醇基团，前人报道由于硫醇基团与金属离子(如Hg2+、Cu2+)有很强的结合作用，形成稳定的S-Hg2+/S-Cu2+络合物，但硫代反应型荧光传感器的特异性较差。

而论文中的CDs-Cu2+很少对生物硫醇有反应，更不用说其它没有巯基的氨基酸。可以推测，辅酶A 比生物硫醇有着更强的结合CDs-Cu2+的能力，生物硫醇不能还原猝灭的荧光。因此，在浓度范围(0~150 μM)内，相对荧光强度比(F520/F668)与CoA浓度呈极好的线性相关关系，检出限＜8.75 nM。

为了探索白胡椒衍生CDs 的实用性，该方法选取了2 个猪肝样品，回收率为93.3%~108.0%，相对标准偏差(RSD)为2.3%~4.5%。

1.3 酶反应法

1988 年，K.M.Knights 等人研究了一种单步酶反应，即由细菌产生的酰基辅酶A 合成酶催化棕榈酸和辅酶A 形成棕榈酰辅酶A。在必要的辅助因子存在的情况下，酶促反应依赖于辅酶A 的浓度。实验证实，棕榈酰辅酶A 的形成依赖于ATP、MgCl2、辅酶A 和酰基辅酶A 合成酶的存在。

当脱磷酸辅酶A、乙酰辅酶A 或取代辅酶A(CoA-SS-CoA)作为酰基受体时，反应并没有继续下去(没有棕榈酰辅酶A 形成)。优化出的实验条件为pH=8.4、6.2 mM MgCl2、0.05% Triton X-100 和10 min 孵育。

该方法在1~250 pmol 范围内定量辅酶A 时得到的标准曲线，相关系数和变异系数分别为0.999和4.2%。棕榈酰辅酶A 的形成虽然与辅酶A 浓度线性相关，但未表现出化学计量关系，因此，需要一个标准的曲线来定量组织提取物中的辅酶A。

当加入150 pmol/mL~12.5 nmol/mL 范围内的匀浆时，从大鼠肝脏匀浆(6.6%)中辅酶A 的回收率为99.1±3.6%(平均值±SD,n=5)。此外，在等物质的量浓度辅酶A 的反应混合物中加入乙酰辅酶A、脱磷辅酶A 或CoA-SS-CoA，没有显著的的棕榈酰辅酶A 形成。

结果表明，在所述实验条件下，使用的二硫苏糖醇浓度并不促进硫酯向辅酶A 的转化。将该方法应用于大鼠肝组织匀浆、线粒体和肝细胞游离浓缩物浓度的测定，验证了该方法的有效性。

使用终点磷酸转乙酰酶测定时，大鼠肝脏的辅酶A 含量约为156 nmol/g。当使用K.M.Knights 等人的技术测定肝匀浆样品中辅酶A 含量时，其值为106.9±21.8 nmol/g。

两种方法测得肝脏中辅酶A 的浓度之间的差异可以根据动物的代谢状态(喂或不喂)的差异来解释。与从肾移植供体获得的样本(91.9±6.2 nmol/g)相比，死后获得的人肝组织辅酶A 含量降低(66.1± 3.7 nmol/g)，表明死后辅酶A 丢失。然而，在-80 ℃储存5 周之前和之后进行检测，结果显示，辅酶A 的损失最小，之前为89.5 nmol/g，而之后为83.6 nmol/g。

此分析方法为测定肝匀浆和分离的线粒体和肝细胞悬浮液中的辅酶A 提供了一种非常灵敏的技术手段。

1.4 色谱法

高效液相色谱(HPLC)是最常用的分离方法，可与不同的检测器相结合。

1996 年，A. H.Lokkerbol 等人建立一套分析CoA 代谢所涉及各种辅酶A-酯底物和产物的分析体系，建立检测17 个短链辅酶A 酯的高效液相色谱体系。

所有HPLC 分析均在室温下进行，采用十八烷基硅胶柱，磷酸钠缓冲液和乙腈梯度洗脱。使用0.2 M、pH=5.0 磷酸钠缓冲液-乙腈(100∶5)洗脱液，在22 min 即可完成测定，但待分析混合物中的dPCoA 酯的分辨率没有达到效果。

用甲醇代替乙腈作为有机溶剂进行洗脱，不仅能改善峰形，还能使乙酰乙酰辅酶A 和乙酰辅酶A 达到较好的分离效果。

实验选用pH=5.0 缓冲液-甲醇(100∶20)组成的洗脱液，辅酶A 和乙酰辅酶A 的k'（容量因子）值分别为1.3 和3.8，10 min 内完成分离(流速为1.5 mL/min)。此外，使用含甲醇的洗脱液，即使有机溶剂含量的微小变化，也不会导致保留时间的显著变化。

研究了CoA 酯注入浓度与检测器输出量之间呈良好的线性关系，范围在0.5~10 nmol 之间，检出限为2.5 pmol。

虽然色谱法经典，但往往需要浓缩过程来提高检测的灵敏度，从而导致样品严重受损。而且，该方法也相对复杂，需要昂贵的仪器和训练有素的技术人员来操作。

1.5 毛细管电泳

毛细管电泳(CE)在分离方法方面优点很多，如试剂和样品用量小，分离效率高，节省时间等。CE 也有一定的局限性，尤其是在灵敏度高的检测中，所用的毛细管内径很小(50-75 μm),只允许体积小的样本被注入系统中。由于毛细管体系的样品注入量低(以纳升为单位)，CE 常与高灵敏度检测器联用。

紫外光谱法（UV）以其低成本、易操作等优点，可与色谱等先进技术结合起来，而成为一种检测手段。

1.5.1 研究实例一

2003 年，Liu 等人首次用254 nm 的紫外检测-毛细管电泳法对12 种不同的CoA 进行了分离和定量。所有12 个CoAs (辅酶A、戊二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、琥珀酰辅酶A、甲基巴豆酰辅酶A、异丁酰辅酶A、氧化辅酶A、乙酰辅酶A、巴豆酰辅酶A、n-丙酰辅酶A、乙酰乙酰基辅酶A、丙二酰辅酶A)均在-30 kV 条件下，在含有0.1% β- 环糊精的100 mM NaH2PO4运行缓冲液中被完全分离。总分离时间＜30 min，信号响应在2个数量级(1~100 nmol)上呈线性，检测限在皮物质的量范围内。

研究了4 种不同缓冲浓度(25、50、75 和100 mM)来比较12 种CoAs 的分离效率和峰间分辨率。通过一系列实验发现，CoAs 的分离对磷酸盐浓度非常敏感。随着缓冲液浓度的增加，各CoA 的洗脱顺序不变，分离效率和峰形均有较大提高。随着缓冲液浓度在100 mM 以下逐渐降低，峰宽越来越宽，分辨率越来越差。CoAs 的迁移可能是通过氢键或络合物的形成与磷酸基密切相关。

优化出磷酸盐(pH = 6.0)最佳浓度为100 mM。然而，在高缓冲浓度下，高压会产生大量的焦耳热，最终影响分离效率，导致电流击穿。为了解决这个问题，在整个分离过程中，使用了冷却系统使分离柱保持在15 ℃。

此外，经过3 次运行后，缓冲溶液两边的离子强度不再平衡，导致分辨率较差。因此，每3 次运行就替换1 次缓冲液，以保持良好的分离条件。

缓冲液pH 在可电离分析物的分离中起着重要的作用，因为它决定了每一种分析物的电离程度，同时也影响着毛细管壁的表面。

检测了8 个CoA 化合物的pH 值，范围为3.5~7.0，随着缓冲液pH 值的增加，分离功率也随之增加。然而，当缓冲pH 值＞6.5 时，迁移时间急剧增加。因此，为了在合理的时间内获得较好的分离效果，优化pH 值，最佳pH=6.0。

没有任何添加剂，CoAs 是无法分离的。Liu 等人检测了各种添加剂，如SDS，β-CD，PVP，PEO。经过一系列的设计实验，Liu 等人发现只有β-CD可以有效的分离所有的CoAs。为了在最小的基线噪声和合理的洗脱时间(＜25 min)内实现良好的分离，接下来的研究中将β-CD 浓度维持在0.1%。利用毛细管电泳研究了β-CD 辅助分离对手性和非手性分子的影响。

高效毛细管电泳-紫外检测法测定辅酶A 的线性范围为1~100 nmol，相关系数为0.988，检出限为55 pmol。实际样为大鼠肝脏，测得辅酶A 的浓度为10.35±1.14 nmol/g。

虽然CE-UV 可成功用于测定辅酶A，但其还存在一些固有的缺陷，如毛细管直径小，容量受限，光程短，于紫外检测器的灵敏度较低。

1.5.2 研究实例二

2010 年，Yongqing Jiang 小组报道了毛细管电泳-激光诱导荧光检测植物组织中短链辅酶A 的分离与定量研究。

在各种组织中测量短链和长链CoA 化合物的高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳-紫外(CE-UV)检测已被报道，但这些技术不允许同时敏感地测定所有可能在植物组织中共存的CoA 及其衍生物。

在该文中建立了毛细管电泳结合激光诱导荧光检测器(CE-LIF)定量测定植物组织中5 种短链CoAs。在优化衍生化和电泳条件下，用荧光素-5-异硫氰酸酯(FITC)衍生CoAs 后使用75 mm (i.d.)、57 cm 的熔融石英毛细管和150 mM 硼酸盐缓冲液(pH=9.00)作为背景电解质进行分离和定量，在皮物质的量水平上，分离过程在25 kV 下进行，不到13 min 就完成了。

衍生化时间、缓冲液浓度和pH 值对衍生化效率的影响也进行了系统的研究，5 种短链CoAs 检出限达到0.26~1.37 nmol/L。

1.6 液质联用仪

2015 年，Neubauer 等人建立了一种基于液相色谱串联质谱检测(LC-MS/MS)相结合的代谢物分析方法，解决了细胞内辅酶A(CoA)、辅酶A 二硫和短链酰基辅酶A 硫酯的绝对定量问题。

作者利用反相色谱分离方法，没有使用离子对试剂(该方法的一个关键优势)，就能分离出CoA 及其相应的衍生物和同分异构体。离子强度和水相的pH 值对色谱有很大的影响。在较低的pH 值和离子强度溶液中，出现大量的峰尾。为避免较高的pH 值和离子强度，常用乙腈作为有机相保证最佳的分离效率。

Neubauer 等人提出了用甲醇代替乙腈的色谱法，并结合ICP-MS 对CoA 进行磷和硫的绝对定量分析。LC 与MS/MS 方法相结合，将其应用于细胞提取物中CoA 的分析。

Neubauer 等人定义了CoA 定量的关键因素，即标准纯度、溶液稳定性和正确选择内部标准。观察标准中iso-CoAs 的发生情况，通过优化色谱，消除了它们对准确定量的潜在负面影响。

由于游离辅酶A 是酰基辅酶A 标准品中不可避免的杂质，因此，必须使用单独的标准溶液对其进行定量，并成功使用了含有CoAs 的全标记U13C 细胞提取物作为内标物。

此外，内部标准化使得研究代谢物(琥珀酰辅酶A 除外)的测量周期为30 h。利用市场上可以买到的标准物质，制得标准溶液，测得100 mol/L 的辅酶A 的信噪比（S/N）为14，检出限为3.8 nM，检测极限为12.5 nM，相对标准偏差为7.4%。

1.7 比值比色法

2016 年，Wu 等人介绍了一种利用金纳米粒子(AuNPs)和双铀酰双硫磷(BUBSS)作为光学探针，采用比色法测定CoA 的方法。

BUBSS 是一种双核铀酰络合物，由2 个铀酰离子和双硫磷酚螯合反应形成。首先，CoA 通过巯基被AuNPs 捕获，形成CoA-AuNPs；然后，BUBSS 通过铀酰离子与CoA-AuNPs 中的磷酸基团发生配位反应，将2 个CoA-AuNPs 结合在一起，这就引起CoA-AuNPs 聚合，并导致溶液的颜色从葡萄酒红色变为蓝色。

基于在650 和525 nm 吸光度比值(A630/A525)变化的测定，建立了CoA 的比值比色法。线性范围为0~1.2 μmol/L，检测限为6 nmol/L。该方法成功地应用于加标肝脏样品中CoA 的测定，回收率为99.4%~102.6%。

以上综述的每一种方法都各有其优缺点，本文对其进行了分析。测定方法的线性范围、检出限和所用材料或技术见表1。