响应曲面法优化还原型特利加压素氧化工艺研究

史文青 葛传军 陈 冉 董世建 李增礼 王荣海 许 培*

(安徽安科生物工程＜集团>股份有限公司,合肥 安徽 230088)

特利加压素(Terlipressin)为化学合成多肽化合物,临床用于治疗严重急性食管静脉曲张破裂出血,严重急性胃、十二指肠溃疡出血,急性糜烂性胃炎或出血性胃炎,对肝硬化顽固性腹水具有一定疗效,联合白蛋白治疗可以显著提高Ⅰ型肝肾综合征的缓解率、减低死亡率[1-3]。

其分子式为：C52H74N16O15S2,分子量为1227.4。

结构式为：H-Gly-Gly-Gly-c(Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys)-Pro-Lys-Gly-NH2

还原型特利加压素肽链上不同位置的半胱氨酸之间形成的二硫键,可以将肽链折叠成特定的空间结构。二硫键是蛋白质或多肽分子中两个不同位点半胱氨酸(Cys)的巯基(-SH)被氧化形成的S-S 共价键。二硫键在维持多肽的空间立体结构及由此决定的生物活性中发挥着重要的作用,特利加压素需要二硫键的存在才具有活性。形成二硫键的方法有很多：空气氧化法,DMSO 氧化法,过氧化氢氧化法等[4-6]。本研究采用30%过氧化氢为氧化剂对还原型特利加压素进行氧化过程研究。

QbD(质量源于设计)重要理念之一是产品的质量无法通过检验赋予,而是通过设计赋予的。研究者应对工艺路线及工艺参数进行全面的筛选研究,以加强对产品性能知识的了解。如ICH Q8 中提出,研究者可以对工艺参数进行风险评估后加以调整和优化,明确各个变量的重要性及其潜在的相互作用。一旦确定了重要参数,可以对其作进一步研究(如通过试验设计组合、数学模型或相关的机理研究),从而对工艺有更深的了解[7]。在药品研发工作中,常需要研究响应值y 究竟如何依赖于自变量,进而找到自变量的设置,使得响应值得到最佳值(望大、望小或望目)。响应曲面法(RSM)是目前国际上较为流行的试验设计及数据分析方法,可用于定量分析各因子及交互作用对响应值的影响[8-9]。本研究以氧化率为响应值,通过响应曲面法,获得还原型特利加压素的最佳氧化工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

还原型特利加压素(批号211201-F01-01, 肽含量68%)由安徽安科生物工程(集团)股份有限公司提供。

醋酸特利加压素(批号150701-202002)购自中国食品药品检定研究院；30%过氧化氢(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司；冰醋酸(分析纯)购自天津市永大化学试剂有限公司；氢氧化钠(药用辅料)购自湖南尔康制药股份有限公司；磷酸二氢钠(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司；磷酸(HPLC 级)购自美国ACS 科恩化学公司；乙腈(HPLC 级)购自美国TEDIA 公司。

1.2 仪器与设备

ML304T/02 型电子天平购自瑞士 METTLER TOLEDO 公 司；FE28 型pH 计 购 自 瑞 士METTLER TOLEDO 公司；DF-101S 型集热式磁力搅拌器购自常州国宇仪器制造有限公司；KDC-0510 型低温恒温槽购自南京肯凡电子科技有限公司；LC-20AT 型高效液相色谱仪购自日本Shimadzu 公司。

1.3 方法

1.3.1 含量测定

1.3.1.1 色谱条件

采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A 为0.067mol/L 磷酸二氢钠(用磷酸调pH 值至3.5),流动相B 为乙腈；线性梯度洗脱：0～4min：8%B→8%B,4～18min：8%B→15%B,18～30min：15%B→20%B,30～30.1min：20%B→8%B,30.1～40min：8%B→8%B；检测波长为210nm；柱温：28℃。

1.3.1.2 测定法

取本品适量,精密称定,加水溶解并稀释制成每1ml中约含特利加压素0.2mg 的溶液,精密量取20μl 注入液相色谱仪,记录色谱图；另取醋酸特利加压素对照品适量,同法测定。按外标法以峰面积计算,即得。

1.3.2 氧化率

由1.3.1 测定样品含量,氧化率如下式计算：

1.3.3 还原型特利加压素氧化工艺

将一定量还原型特利加压素置于洗净并干燥的烧杯,加入一定量纯化水搅拌溶解(搅拌转速500 转/min),完全溶解(目测无可见不溶颗粒)后,用1mol/L 氢氧化钠水溶液将粗品溶液pH 调节至设定值,加入30%双氧水,控制好氧化剂与样品摩尔比(以还原型特利加压素计算),以500 转/min 转速在一定温度条件下搅拌反应液,反应结束后,用冰醋酸将粗品溶液pH 调节至3.0 终止氧化反应,即刻取样检测样品含量。

1.3.4 还原型特利加压素氧化工艺部分析因试验

根据部分析因试验的基本原理[8],以氧化率为响应值,对氧化工艺进行因子筛选试验,运用分析软件进行试验设计,并对试验结果进行分析,比较反应时间、样品浓度(以还原型特利加压素计算)、反应pH、氧化剂与样品摩尔比(以还原型特利加压素计算)、反应温度对氧化工艺的影响。

1.3.5 响应曲面法优化还原型特利加压素氧化工艺

根据Box-Benhnken 的中心组合试验设计原理[8],以氧化率为响应值,对氧化工艺进行优化,运用分析软件进行试验设计,并对试验结果进行分析,获得最优氧化条件。

2 结果与分析

2.1 还原型特利加压素氧化工艺因子筛选试验

通过风险评估确定还原型特利加压素氧化工艺的五个主要因子：反应时间、样品浓度(以还原型特利加压素计算)、反应pH、氧化剂与样品摩尔比(以还原型特利加压素计算)、反应温度分别用X1,X2,X3,X4,X5表示。根据部分析因试验的基本原理,以氧化率为响应值,对氧化工艺的五个因子进行五因子二水平三中心点(分辨度Ⅴ)的因子筛选试验。

根据表1,设计不同的反应时间、样品浓度(以还原型特利加压素计算)、反应pH、氧化剂与样品摩尔比(以还原型特利加压素计算)、反应温度,进行19 次试验,试验设计与结果见表2。

表1 部分析因试验因子水平及编码

表2 部分析因试验设计与结果

采用分析软件对表2 数据进行回归分析,得到回归模型如下：

Y(%)=1.055-0.00130X1-0.0443X2-0.0279X3-0.00002 X4-0.00013X5+0.000560X1X2+0.000044X1X3-0.000025X1X4+0.000006X1X5+0.00580X2X3-0.000365X2X4-0.000355X2X5+0.000149X3X4+0.000100X3X5+0.000006X4X5+0.04752CtPt,模型方差分析见表3。

表3 回归模型方差分析

由表3 可以看出,一次项,X3显著；X1,X5具有一定显著性；其余项均不显著,将双因子交互作用删除,优化后的模型如下：

Y(%)=0.9243-0.000314X1-0.00194X2-0.008753X3-0.000226X4+0.000253X5+0.04752CtPt,模型方差分析见表4。

表4 回归模型方差分析

由表4 可以看出,X1,X3,X5均显著；X2,X4不显著。

2.2 响应曲面法优化还原型特利加压素氧化工艺

2.2.1 还原型特利加压素氧化工艺响应曲面因子的确定

根据因子筛选试验结果,采用响应曲面设计试验,根据Box-Benhnken 的中心组合试验设计原理,选择对还原型特利加压素氧化工艺有显著影响的三个因素：反应时间(X1)、反应pH(X3)、反应温度(X5),进行三因子三水平的响应曲面试验。本次研究以氧化率为响应值,见表5。

表5 响应曲面试验因子水平及编码

2.2.2 还原型特利加压素氧化工艺响应曲面试验及方差分析

根据表5,设计不同的反应时间、反应pH、反应温度,进行15 次试验,试验设计与结果见表6。

表6 响应曲面试验设计与结果

通过分析软件进行表6 响应曲面回归分析,得到如下多元二次响应曲面回归模型：

Y(%)=-2.101+0.00948X1+0.754X3+0.00969X5-0.0001 44X1X1-0.05065X3X3-0.000108X5X5-0.000142X1X3-0.0000 29X1X5-0.000450X3X5,模型方差分析见表7。

由表7 可以看出,一次项,平方项,X3,X3X3,X1,X1X1显著；X5X5具有一定显著性,其余项均不显著,将双因子交互作用删除,优化后的模型如下：

表7 回归模型方差分析

Y(%)=-1.963+0.00769X1+0.7387X3+0.00544X5-0.000144X1X1-0.05065X3X3-0.000108X5X5,模型方差分析见表8。

表8 回归模型方差分析

由表8 可以看出,X1,X1X1,X3,X3X3显著；X5X5具有一定显著性,各个因子对还原型特利加压素氧化率影响显著性顺序依次为反应pH＞反应时间＞反应温度。氧化工艺回归模型的一次项和平方项均显著,说明各因子对响应值的影响不是简单的一次线性关系；模型项显著,说明该模型有效且具有可信性和准确性；失拟项不显著说明模型无失拟,试验误差很小。

2.2.3 还原型特利加压素氧化工艺响应曲面分析

做出响应曲面,分析反应时间(X1)、反应pH(X3)、反应温度(X5)对还原型特利加压素氧化率的影响情况,结果见图1。

由图1 可以看出,随着反应时间的增加,还原型特利加压素氧化率增加,当反应时间达到26.72min 时,反应基本达到平衡,继续增加反应时间,将会引起副反应产生,降低氧化率。随着反应pH 的升高,还原型特利加压素氧化率先升高后陡降,当反应pH 为7.29 时,氧化率最高,这是因为半胱氨酸在碱性溶液中易被氧化,但反应pH 值过高时,将会引起副反应,降低氧化率。随着反应温度的升高,还原型特利加压素氧化率先升高后降低,当反应温度为25.25℃时,氧化率最高,这是因为反应温度高,反应物活性大,反应速度加快,使得氧化率提高,但温度过高时,将会引起副反应,降低氧化率。

图1 各因子影响还原型特利加压素氧化率的响应曲面

通过分析软件进行还原型特利加压素氧化工艺参数优化,最佳反应条件为：反应时间26.72min、反应pH7.29、反应温度25.25℃,最高氧化率为90.14%。采用上述优化条件进行三次验证试验,得到的还原型特利加压素氧化率分别为90.29%,90.07%,90.18%。

3 结论

本研究采用过氧化氢氧化还原型特利加压素,先通过部分析因方法进行因子筛选试验,然后通过响应曲面法的Box-Benhnken 模型对还原型特利加压素的氧化工艺进行优化,建立了二次多元回归模型方程, 并对影响氧化率的各因子进行分析探讨。

试验结果表明,在五个主要因子中,样品浓度(以还原型特利加压素计算)、氧化剂与样品摩尔比(以还原型特利加压素计算)对还原型特利加压素氧化率的影响不显著。反应时间、反应pH、反应温度对还原型特利加压素氧化率的影响显著,其中各个因子对氧化率的影响显著性顺序依次为反应pH(X3)＞反应时间(X1)＞反应温度(X5)。优化后的还原型特利加压素氧化率的二次多元回归模型方程如下：

Y(%)=-1.963+0.00769X1+0.7387X3+0.00544X5-0.000 144X1X1-0.05065X3X3-0.000108X5X5

本试验得出的最佳反应条件为：反应时间26.72min、反应pH7.29、反应温度25.25℃,在该条件下还原型特利加压素的氧化率为90.14%。