肺磨玻璃结节患者血清炎症因子及髓源性抑制细胞的表达水平及临床意义*

郭婧瑶 骆莹滨 吴建春 张博 李雁

肺结节是影像学直径≤3 cm的局灶性、类圆形、密度增高的实性或亚实性肺部阴影，可为孤立性或多发性[1]。随着人们对于健康的重视，以及常规体检的普及，肺结节的诊出率较前显著提高。根据结节密度又分为实性和亚实性结节，磨玻璃结节 （ground-glass nodule，GGN） 属于亚实性肺结节，具有恶变风险。研究显示约有75%持续存在的肺GGN最终会诊断为腺癌[2]。目前对于肺结节的研究集中在良恶性的诊断，主要以影像学结果为主，并参考肿瘤标志物等进行综合评估。通常建议直径＞1 cm的肺GGN采取有创性病理检查或手术治疗，直径≤1 cm的肺GGN多以随访观察为主。除去常规影像学检查，以肿瘤标志物为主的临床检验指标相对较为单一。研究显示，肺GGN的主要原因与肺泡腔内的渗出液、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞浸润有关[3]。上述细胞分泌的炎症因子又可改变炎性微环境，促炎细胞因子表达增加会促进肿瘤的发展[4]。此外，MDSCs是一群处于不同分化阶段的表型未成熟的髓样细胞，涉及免疫调节的各个方面，包括慢性炎症、感染、自身免疫性疾病，肿瘤等疾病[5]。前期研究也表明肿瘤患者外周血中的MDSCs水平与肿瘤负荷、分期以及多种恶性肿瘤的预后不良相关[6-7]。因此，本研究旨在探究直径≤1 cm的肺GGN患者炎症因子及MDSCs表达水平的临床意义，以期为肺GGN患者的精准化管理和动态评估提供一定临床依据，便于及时采取适当的干预措施。

1 材料与方法

1.1 临床资料

采用前瞻性研究方法纳入2020年4月至2021年7月就诊于上海中医药大学附属市中医医院，肺GGN直径≤1 cm的患者111例。纳入标准：1）经影像学明确诊断为肺GGN患者且首次确诊时间≤3个月；2）肺GGN最大者直径≤1 cm；3）年龄≥18岁；4）一般状态良好，ECOG评分0～1分；5）入组前1个月内未使用抗生素、免疫抑制剂、糖皮质激素类等药物治疗。排除标准：1）入组时诊断结节为恶性者；2）合并其他部位肿瘤或免疫系统疾病；3）随访期间进行药物干预肺结节的患者。脱落（失访）标准：1）随访期间无法通过电话及门诊等随访方式联系患者本人；2）入组后未按规定时间完成影像学检查。本研究经本院医学伦理委员会批准（伦理批件号：2016SHL-KYYS-16），受试者均已签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 分组 参考肺结节诊治中国专家共识根据肺结节直径大小分为微小结节组（直径＜5 mm）、小结节组（直径为5～10 mm），其中微小结节组36例；小结节组75例。

1.2.2 临床样本采集及检测方法 所有受试者在入组后采集静脉血2 mL于促凝管中，经本院检验科检测炎症因子（IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α）的表达。另采集静脉血2 mL于EDTA抗凝管中，取血浆缓慢加入2 mL的淋巴细胞分离液（购自中国Yeasen公司），以300 g离心15 min后提取单个核细胞，加入2 μL FITC-CD33、PE-CD11b及PC5.5-HLA-DR流式抗体（购自美国Biolegend公司），避光染色30 min，经PBS洗涤后用流式细胞仪检测MDSCs百分比。采用FlowJo V10.0软件进行数据分析。

1.2.3 观察指标 入组后检测各组受试者炎症因子（IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α）及MDSCs的表达水平，分析组间差异。然后每半年随访1次，根据影像学结果统计各组肺结节变化情况，分析肺结节变化的风险因素，对风险因素进行ROC曲线分析，测定截断值，分析不同表达水平风险因素与疾病进展的相关性。本研究截止随访至2022年1月。研究终点（疾病进展）：1）经胸部LDCT检查发现肺GGN直径增大≥2 mm；2）新出现的肺部结节[8]。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用±s表示，组间比较采用独立样本t检验；非正态分布的资料采用中位数（M）和四分位数间距（interquartile range，IQR）表示，组间比较采用非参数检验。计数资料的组间比较采用x2检验。采用Logistic二元回归及ROC曲线进行单因素分析及临床指标预测价值分析。绘制Kaplan-Meier生存曲线分析不同表达水平的风险因素对肺GGN进展的影响。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 微小结节组和小结节组比较

2.1.1 一般临床资料比较 本次随访过程中微小结节组有3例患者和小结节组有5例患者因未能按时完成影像学检查而失访，根据纳入和排除标准本研究最终纳入111例患者，其中微小结节组36例，小结节组75例。两组间性别、年龄、吸烟史、家族史、结节数量（分为孤立性和多发性结节）差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组患者一般临床资料比较

2.1.2 炎症因子及MDSCs表达水平比较 小结节组较微小结节组MDSCs比例升高，差异具有统计学意义（P=0.046），见图1和表2。两组间炎症因子IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

图1 流式细胞术检测两组间MDSCs百分比

表2 两组间炎症因子及MDSCs表达水平比较

2.1.3 肺GGN进展比较 两组间患者疾病进展人数比较，结果显示两组间疾病进展率差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 两组间肺GGN变化率比较

2.2 肺GGN进展分析

2.2.1 肺GGN进展的单因素分析 经单因素回归分析发现，肺GGN进展与结节数量、吸烟史、家族史、炎症因子IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α表达无关，MDSCs比例是影响肺GGN进展的危险因素（P=0.046），见表4。

表4 肺GGN单因素分析

表4 肺GGN单因素分析 （续表4）

2.2.2 MDSCs比例与结局指标ROC曲线分析 经ROC曲线分析发现，MDSCs比例对于肺GGN进展有一定预测价值。MDSCs的曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.781（95%CI：0.663～0.900，P=0.003）。统计分析得出MDSCs百分比最佳截断值为4.57，见图2。

图2 MDSCs百分比与结局指标ROC曲线分析

2.2.3 不同MDSCs表达水平对肺GGN进展的影响分析 根据截断值分为MDSCs高水平表达组（MDSCs≥4.57%）和低水平表达组（MDSCs＜4.57%）。生存分析结果显示，MDSCs低水平表达组较高水平表达组的疾病稳定期更长，差异具有统计学意义（P=0.001），见表5和图3。

表5 不同MDSCs表达水平对肺GGN进展的影响分析

图3 不同MDSCs水平患者疾病稳定期的K-M曲线

3 讨论

随着高分辨率计算机断层扫描和低剂量螺旋CT的广泛应用，肺结节的检出率较前显著提高。国外的一项研究显示，每年约有30%的胸部CT发现肺结节[9]。影像学可通过影像学观察结节的大小、形状、边界、密度、钙化的存在、钙化的模式、生长速度和叶的位置等综合判断结节的良恶性[10]。肺GGN持续超过3个月且直径＞1 cm时，其恶性概率约为10%～50%[9]。通常管理直径≤1 cm肺GGN患者建议定期复查胸CT。但是CT也存在一定的假阳性且不同研究的假阳性率差异很大，基线筛查的总体假阳性率为7.9%～49.3%。此外，过度的CT筛查和诊断也会造成医疗资源的浪费以及因不确定性增加患者的短期痛苦，增加患者抑郁情绪，甚或出现少见的因辐射诱发癌症的情况[11-12]。有研究发现肺结节的发病与性别、年龄、职业暴露、吸烟、生活压力以及慢性炎症等有一定相关性[13-14]。本研究结果也显示女性肺GGN患病率要明显高于男性患者。Li等[15]通过荟萃分析53项临床研究，纳入8 793例肺GGN肺癌患者的临床资料发现其中女性比例、平均诊断年龄和不吸烟比例分别为0.62、56.97和 0.72，提示GGN肺癌患者的临床特征可能脱离了高危因素。因此为了识别上述具有低风险因素的极早期 GGN肺癌患者，有必要重新考虑风险评估标准。

MDSCs存在于癌症、慢性传染病、创伤、败血症和许多其他病理状况中具有免疫抑制活性并限制免疫反应的一类未成熟的髓系来源细胞。MDSCs主要由两大群细胞组成，粒细胞或多形核（PMN-MDSCs）和单核细胞（M-MDSCs），前者在表型和形态上与中性粒细胞相似，后者在表型和形态上均与单核细胞相似[16]。在人类中，M-MDSCs表面分子标记物为CD11b+CD14+CD33+HLA-DRlow/neg，而G-MDSCs为CD11b+CD15+HLA-DRlowCD66b+[17]。MDSCs具有的免疫抑制功能可帮助肿瘤逃避免疫监视，是促进肿瘤发展和进展的关键介质[18]。本研究发现同样MDSCs在微小结节组和小结节组之间表达存在差异，小结节组MDSCs表达比例更高，同时与肺结节进展有相关性，说明随结节增大患者更易出现免疫抑制情况，MDSCs是影响肺GGN进展的危险因素，或可为肺GGN进展预测提供一定参考依据。此外，MDSCs和炎症因子之间也可互相影响。有研究发现，IL-6是MDSsC聚集和激活的关键调节因子，也是刺激肿瘤细胞增殖、存活、侵袭和转移的一个因素[19]。考虑肺结节的发生与慢性炎症相关，炎性细胞及免疫细胞浸润释放炎症因子将进一步影响GGN的发展。现有的临床研究也指出炎症因子在区别结节良恶性方面有一定临床意义[20-21]。因此，本研究还比较了微小结节与小结节患者之间的炎症因子表达水平，但结果显示无显著性差异，说明直径≤1 cm的肺GGN患者炎症水平相当，对肺GGN进展无明显影响。但因样本量较少，所以可能存在假阴性的结果。

另外，本研究比较肺GGN大小与疾病进展的关系，发现微小结节和小结节在疾病进展率上无显著性差异。这可能与直径≤1 cm的肺结节恶性率较低且GGN多进展缓慢有关。通过进一步分析影响GGN进展的危险因素，发现结节大小、数量、吸烟史和家族史不是其独立危险因素。相似的是同样有研究表明肺癌概率不随结节数显著变化，基线结节计数无助于区分良性和恶性结节[12]。且因本研究中女性肺结节患者较多，有吸烟史人数较少，对于结果也会产生影响。

总体而言，本研究以直径≤1 cm的肺GGN患者的血清炎症指标和MDSCs表达水平为切入点，发现结节大小与MDSCs的比例相关，同时MDSCs的表达水平与肺GGN进展也存在一定关联。此发现丰富了肺GGN在免疫及炎症指标方面的临床研究，为肺GGN风险预测带来积极的临床意义。但是本研究也存在一定局限性，即所得结果提示MDSCs的临床预测价值有限，还不足以建立准确的风险预测模型。同时因为样本量较小，随访时间有限，对结果可能造成一定偏倚，因此后续还应扩大样本量，以期为低风险GGN患者管理提供更多的临床参考依据。