光皮木瓜薄层鉴别方法改进研究

谢俊飞，朱田密，唐 甜，段雪云，陈树和

(1.湖北省中医院/湖北中医药大学附属医院 药事部，湖北 武汉 430061；2.湖北中医药大学 药学院，湖北 武汉 430065)

光皮木瓜是蔷薇科植物木瓜(榠楂)Chaenomelessinensis(Thouin)Koehne的成熟果实，是药食两用植物，主产湖北、陕西、山东、安徽、江苏等地[1-2]。因其干燥后果皮不皱缩，因而被称为“光皮木瓜”[3]，或简称为“光木瓜”。光皮木瓜具有和胃舒筋、祛风除湿、消痰止咳的功效，用于吐泻转筋、风湿痹痛、咳嗽痰多、泄泻、痢疾、脚气水肿等[1]，主要化学成分含有机酸类、甾类、三萜类、木脂素类、黄酮类等，具有抗肿瘤、免疫调节、抗菌等多种生物活性，临床应用较广[4-5]。外皮皱缩的中药材木瓜是光皮木瓜的常见易混淆品，二者的植物基源为同属近缘种，功效有相似之处，但为两种不同的中药。中药材木瓜收载于《中国药典》，光皮木瓜则被地方中药材标准收载[1，6]。《湖北省中药材质量标准》2018年版收载的光皮木瓜质量标准中以光皮木瓜对照药材为对照，采用硅胶色谱鉴别光皮木瓜中的特征成分黄酮类，但薄层色谱不够清晰，分离度不足。因此，本研究对光皮木瓜的薄层鉴别方法进行改进，提高鉴别方法的准确性。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ES225SM-DR电子天平(瑞士普利赛斯公司)；AS 220.R2型电子天平(波兰RADWAG公司)；KQ-500VDE型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH-6恒温水浴锅(金坛市易晨仪器制造有限公司)；UPT-II-10 T优普系列超纯水器(成都超纯科技有限公司)；FW-80高速万能粉碎机(上海科恒实业发展有限公司)；ZY-600U薄层色谱自动成像分析系统(北京先驱威锋技术开发公司)。

1.2 试药

槲皮苷对照品(批号111538-202007)，芦丁对照品(批号100080-201409)，绿原酸对照品(批号110753-202018)，熊果酸对照品(批号110742-201823)，木瓜对照药材(121003-201206)，均购自中国食品药品检定研究院；光皮木瓜对照药材(自制)，光皮木瓜药材，木瓜药材(见表1)由湖北省中医院朱田密副主任药师鉴定为正品，标本留存于湖北省中医院中药研究所；聚酰胺薄膜10 cm×10 cm，由浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂提供；薄层层析硅胶G和硅胶G预制板由青岛海洋化工厂提供；甲醇、甲酸、乙醚、乙醇、乙酸乙酯、冰醋酸、环己烷、丙酮、三氯甲烷等试剂均为分析纯，水为纯水。

表1 样品信息

2 方法与结果2.1 槲皮苷、芦丁、绿原酸的薄层色谱鉴别

取本品粉末1 g，加乙醚25 mL，加热回流1 h，滤过，弃去乙醚液，药渣挥尽乙醚，加乙醇25 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液[1]。另取光皮木瓜对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取槲皮苷对照品、芦丁对照品、绿原酸对照品，分别加甲醇制成每1 mL含有0.03 mg的槲皮苷溶液和芦丁溶液，以及每1 mL含有0.1 mg的绿原酸溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，吸取上述五种溶液各0.2 μL，分别点于同一聚酰胺薄层板上，以甲醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果：供试品色谱中，在与绿原酸对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝白色荧光斑点。再喷以5%三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果：供试品色谱中，在与光皮木瓜对照药材色谱相应的位置上，以及槲皮苷、芦丁对照品色谱相应位置上，显相同的黄色荧光斑点。色谱斑点清晰，分离度好，见图1。

注：1.槲皮苷；2.芦丁；3.光皮木瓜样品1；4.样品2；5.样品3；6.样品4；7.样品5；8.样品6；9.样品7；10.光皮木瓜对照药材；11.绿原酸；12.样品8(木瓜)。另外，本研究木瓜供试品溶液的制备方法与光皮木瓜相同。图1 光皮木瓜中槲皮苷、芦丁与绿原酸的薄层色谱

2.2 熊果酸的薄层色谱鉴别

取本品粉末1 g，加三氯甲烷10 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇-三氯甲烷(1∶3)混合溶液2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取光皮木瓜对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取熊果酸对照品，加甲醇制成每1 mL含有0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，吸取上述溶液各1～2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(6∶0.5∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365 nm)下检视[6]。结果：供试品色谱中，在与光皮木瓜对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点和荧光斑点；在与熊果酸对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点和橙黄色荧光斑点，色谱清晰，斑点明显，鉴别效果较好，见图2。

注：1.熊果酸；2.光皮木瓜样品1；3.样品2；4.样品3；5.样品4；6.样品5；7.样品6；8.样品7；9.光皮木瓜对照药材；10.木瓜对照药材；11.样品8(木瓜)。另外，本研究木瓜对照药材溶液及供试品溶液的制备方法与光皮木瓜相同。图2 光皮木瓜中熊果酸的薄层色谱

3 讨论

3.1 供试品制备方法考察

本研究针对光皮木瓜中黄酮类物质的提取，考察了两种供试品制备方法：方法一即光皮木瓜质量标准原方法，采用乙醚脱脂之后，用乙醇回流提取；方法二采用甲醇超声提取，滤过，滤液蒸干后，残渣加水溶解，再用乙酸乙酯萃取。结果都提取出较多黄酮类物质，但方法一提取出的黄酮苷类略多，故维持原提取方法不变。

3.2 色谱条件的考察

在改进色谱条件过程中，对硅胶色谱试验了多种展开剂：乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(5∶1∶0.5∶0.7)、乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1.5∶0.5)、乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)、三氯甲烷-冰醋酸-甲醇-丁酮(4∶3∶2∶3)、正丁醇-冰乙酸-水(3∶1∶1)、乙酸乙酯-正己烷-甲酸(5∶7∶0.8)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)等，都没有达到理想的分离效果。由于聚酰胺对酚类、黄酮类化合物分离具有优势[7]。故改用聚酰胺薄膜色谱，考察数种展开剂之后，发现菟丝子的薄层分离条件甲醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)能使光皮木瓜中黄酮类斑点达到较好的分离度[6]。值得注意的是，聚酰胺薄膜载样量小，对黄酮类灵敏度高，点样量不可过大，否则斑点向前扩展，导致Rf值偏大。

3.3 对照品的选用

根据光皮木瓜及近缘种所含化学成分的现有研究报道[8-10]，本研究考察了多种对照品，包括芦丁、绿原酸、熊果酸、齐墩果酸、牡荆素、异牡荆素、儿茶素、金丝桃苷、槲皮素、槲皮苷。结果，供试品色谱中难以观察到与牡荆素、异牡荆素、儿茶素、金丝桃苷对照品色谱中相应的斑点，进而采用高效液相色谱比对色谱峰，结果显示光皮木瓜中不含有牡荆素、异牡荆素；虽然含有金丝桃苷，但薄层色谱中难以分辨，故不采用。齐墩果酸与熊果酸互为同分异构体，只是一个角甲基的位置不同[11]，在薄层色谱上Rf值极为接近，故效仿《中国药典》木瓜项下只采用熊果酸作为对照品。实验过程中制备的绿原酸对照品溶液放置8 h再次使用时出现了斑点扩散或两个斑点的现象，表明绿原酸对照品溶液不稳定，需临用前配制。

3.4 光皮木瓜与木瓜的薄层色谱对比

由薄层色谱图可知，不同产地7批光皮木瓜成分基本一致，仅部分色谱斑点强弱有区别。实验中还采用了同属易混品木瓜作对比(图1、图2)，可以看到，光皮木瓜与木瓜的薄层色谱具有明显区别，木瓜中的黄酮类色谱斑点数量和含量远少于光皮木瓜，木瓜中的三萜酸类色谱斑点的强度大于光皮木瓜，故应用该薄层鉴别方法可区分二者。

4 结论

改进后的光皮木瓜薄层鉴别方法提高了黄酮类色谱斑点的分离度，新增槲皮苷、芦丁、绿原酸、熊果酸四种对照品鉴别，提高了光皮木瓜薄层鉴别的准确性(光皮木瓜质量标准原方法[1]的薄层鉴别色谱见图3)。本研究为光皮木瓜的定性鉴别提供了有效方法，可作为光皮木瓜对照药材标定标准中的薄层鉴别方法。

注：1.光皮木瓜样品1；2.样品2；3.样品3；4.光皮木瓜对照药材。图3 改进前的光皮木瓜薄层色谱(365 nm)