基于四氨基酞菁铟功能化石墨烯纳米材料的黄芩苷电化学传感器的构建及性能

王琪铭， 史艳梅*， 魏 森， 吴明侠， 苗明三， 李秀敏

(1.河南中医药大学，河南郑州 450001；2.纽约医学院，美国纽约 10595)

黄芩苷(Baicalin)是从双子叶唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根中分离出来的一种黄酮类化合物，具有抗菌[1]、抗病毒[2]、抗肿瘤[3]、保护肝脏[4]和修复脑损伤[5]等药理作用，在临床上应用极为广泛。基于其良好的药效作用，在众多含黄芩的中药制剂中常被作为质量控制的重要指标。因此，建立快速灵敏的黄芩苷测定方法具有重要意义。现已有的黄芩苷测定方法主要有高效液相色谱法[6]、液-质联用法[7]、毛细管电泳法[8]和电化学法[9]等。其中，电化学法因其灵敏度高，仪器设备简单，易于自动化等优势，在药物活性成分检测中扮演重要角色[10 - 13]。

还原氧化石墨烯(rGO)是一种被广泛应用于电化学领域的二维蜂窝状纳米材料，具有比表面积大的优势[14]，但其在还原制备过程中易产生结构缺陷，影响了其分散性及导电性，进而限制了其在电化学分析中的应用。四氨基酞菁是一种重要的水溶性有机染料，拥有18π电子共轭体系和螯合金属离子能力的中心环[15]，其丰富的π电子结构易于与rGO发生非共价作用，形成稳定的纳米复合材料，能够有效地改善rGO的电化学性能。基于此，本文设计合成了水溶性四氨基酞菁铟功能化石墨烯(rGO-InTAPc)纳米复合材料，并将其用于构建高灵敏的黄芩苷电化学传感器，在实际样品银黄颗粒中取得了满意的结果，为中药制剂的质量监控提供了一种快速的检测手段。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660E工作站(上海辰华仪器有限公司)，采用三电极工作系统：玻碳电极(GCE)或修饰后的GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极；Waters 2695高效液相色谱仪；ME204电子分析天平(Mettler Toledo)； pHS-3C pH计(上海雷磁)；DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱(太仓精宏仪器设备有限公司)；Milli-Q超纯水机(默克密理博实验室设备有限公司)。

黄芩苷、芦丁(98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；石墨粉(99.95%，>325目)、InCl3(无水级)、4-硝基邻苯二甲腈(>98.0%，GC)、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU，99%，阿拉丁化工(上海)有限公司)；Nafion溶液(阿法埃莎化学公司)；K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6](天津光复科技有限公司)；KCl、KH2PO4和Na2HPO4、ZnCl2、MgCl2、NaCl、CaCl2(天津科密欧化学试剂有限公司)；HCl(烟台市双双化工有限公司)。实验所用试剂均为分析纯，实验用水均为超纯水。

1.2 rGO -InTAPc纳米复合材料的制备

以石墨粉为原料，采用改良的Hummers法[13]制备氧化石墨烯(GO)。取50 mL 4.0 mg/mL GO溶液，超声15 min，在搅拌下缓慢加入2.4 mL 80%水合肼溶液，100 ℃回流过夜，然后在6 000 r/min下离心30 min，超纯水洗涤3次后，重新分散在50 mL超纯水中，即为rGO溶液。

InTAPc通过两步化学反应合成。首先，以硝基苯为溶剂，DBU为催化剂，取1.96 g 4-硝基邻苯二甲酸和0.61 g InCl3于茄形瓶中，在氮气保护下180 ℃油浴中搅拌反应24 h，反应液冷却至室温并转移至100 mL冷冻的甲醇中，抽滤，用乙醇清洗至滤液为无色，冷冻干燥后即得四硝基酞菁铟(InTNPc)；然后，以DMF为溶剂，加入所得InTNPc与Na2S，调节油浴温度至50 ℃，在氮气保护下搅拌反应5 h，冷却至室温，抽滤，超纯水洗涤3次，真空干燥后得到InTAPc粉末。

将10 mg InTAPc用20 μL DMF溶解后，与10 mL 1.0 mg/mL rGO溶液混合，将混合溶液于室温下避光搅拌反应过夜，超纯水洗涤至上清液为无色，然后分散于10 mL超纯水中，得到rGO -InTAPc产物。取rGO -InTAPc与0.5%Nafion等比例混合，即得纳米复合物电极修饰液。

1.3 修饰电极的制备

GCE分别用0.3，0.05 μm Al2O3抛光粉打磨至镜面，冲洗后，依次在乙醇和超纯水中各超声清洗1 min，晾干后备用。吸取5 μL 上述电极修饰液滴涂至GCE表面，置于50 ℃烘箱中避光烘干，即可得到rGO -InTAPc/GCE修饰电极。

1.4 电化学分析

在含有黄芩苷的250 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.0)中，采用三电极工作体系，以GCE、rGO/GCE或rGO -InTAPc/GCE为工作电极，在搅拌作用下富集3 min，然后在-0.2～0.6 V电位范围内进行扫描，利用循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)进行分析测定。

1.5 实际样品处理

取银黄颗粒适量，研细，精密称定200 mg银黄颗粒粉末于50 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇40 mL，超声处理30 min，冷却至室温，加50%甲醇定容至刻度，摇匀过滤，收集滤液，即得2 mg/mL的银黄颗粒储备溶液。

1.6 高效液相色谱法检测

采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，以0.1%H3PO4溶液-甲醇(53∶47，V/V)为流动相，在流速为1 mL/min，检测波长为300 nm的条件下，对银黄颗粒中黄芩苷的含量进行分析。

2 结果与讨论

2.1 rGO-InTAPc复合材料的表征

用扫描电镜对rGO -InTAPc纳米复合物材料进行表征。如图1所示，rGO -InTAPc纳米复合材料表面呈薄薄的类丝绸状褶皱的形态，没有明显聚集，该结构可显著提高电极的比表面积，进而增强其电化学响应。

图1 rGO-InTAPc复合材料的扫描电镜图Fig.1 SEM image of rGO-InTAPc nano-composite material

2.2 rGO-InTAPc/GCE的电化学表征

采用CV法评价探针K3[Fe(CN)6]在不同修饰电极上的电化学性能，结果见图2。在GCE、rGO/GCE和rGO -InTAPc/GCE上均有一对可逆的氧化还原峰出现，但与GCE、rGO/GCE相比，K3[Fe(CN)6]在rGO -InTAPc/GCE上的响应信号显著增强，同时背景电流也相应增加，说明rGO -InTAPc纳米材料有效提高了电子传输能力，进而增强电化学响应信号。为探究rGO -InTAPc复合材料的电催化性能，利用CV法在0.01～0.5 V/s的扫速范围内于探针溶液中进行扫描，其CV图及相应的Ipa-v1/2曲线如图2B和2C所示，通过Randles-Sevcik方程[16]计算修饰电极的活性面积，可得rGO -InTAPc/GCE和GCE的电活性比表面积分别为0.415 cm2和0.088 cm2。由该结果可知，rGO -InTAPc复合材料可显著提高电极的活性面积。

图2 (A)Bare GCE、rGO/GCE和rGO -InTAPc/GCE在0.125 V/s扫速下于K3[Fe(CN)6]溶液中的CV图；(B)rGO -InTAPc/GCE在K3[Fe(CN)6]溶液中不同扫描速率下的CV图(a→r：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 V/s)；(C)Ipa和v1/2之间的关系曲线Fig.2 (A)CVs of bare GCE,rGO/GCE,rGO -InTAPc/GCE in K3[Fe(CN)6] solution at scan rate of 0.125 V/s；(B)CVs of rGO -InTAPc/GCE in K3[Fe(CN)6] solution at different scanning rates(a→r：0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.15,0.2,0.25,0.3,0.35,0.4,0.45,0.5 V/s);(C)The relationship curve between Ipa and v1/2

2.3 黄芩苷在rGO-InTAPc/GCE上的电化学行为

采用CV法研究了黄芩苷在GCE、rGO /GCE、rGO-InTAPc/GCE上的电化学行为。如图3A所示，裸GCE上出现一对微弱的氧化还原峰，说明裸电极不利于电子的转移，电化学反应慢；rGO /GCE上出现了一对较强的氧化还原峰，与裸电极相比响应电流明显增强；而在rGO -InTAPc/GCE上，响应电流进一步增大，说明rGO-InTAPc纳米复合材料对黄芩苷具有良好的电催化性能。

图3 (A)不同修饰电极在黄芩苷溶液中的CV图；(B)黄芩苷在不同扫描速率下的CV图(a→l：0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.225、0.25、0.275、0.3 V/s)；(C)峰电流和扫描速率之间的关系曲线；(D)EP和lnv之间的关系曲线Fig.3 (A)CVs of different modified electrodes in baicalin solution;(B)CVs of baicalin at different scan rates(a→l:0.025,0.05,0.075,0.1,0.125,0.15,0.175,0.2,0.225,0.25,0.275,0.3 V/s);(C)the relationship curve between oxidized current and scan rate;(D)the relationship curve between EP and lnv

2.4 实验条件的优化

支持电解质的浓度和pH对电化学检测的灵敏度有重要的影响。在5.0 μmol/L的黄芩苷溶液中，采用CV法对PBS的pH值进行优化，结果如图4A所示。电化学响应电流随着pH的增加而增强，当pH=7.0时达到最大值，而后随pH的增加反而下降，所以选择pH=7.0的PBS为支持电解质。同时，由图4A发现随pH的升高，氧化还原电位发生负移，且其峰电位值与pH呈良好的线性关系(图4B)，线性方程分别为:Epa=0.0609pH+0.6349(r=0.9820)和Epc=-0.066pH+0.5714(r=0.9990)。方程斜率分别为0.0609 V/pH和0.066 V/pH，接近理论值0.0592 V/pH，表明质子参与了该电化学反应并且该反应为一个等质子等电子电化学反应过程。进一步对PBS的浓度进行优化，如图4C所示，电流值随着PBS浓度的增大而增大，250 mmol/L时达到最大值，而后随PBS浓度的增大峰电流值几乎不再变化，所以选取250 mmol/L为PBS最佳浓度。

图4 (A) PBS的pH对响应电流的影响(a→e:5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)；(B)EP -pH的线性关系；(C)PBS的浓度对响应电流的影响Fig.4 (A)Effect of PBS pH on response current(a→e:5.0,6.0,7.0,8.0,9.0);(B)Linear relationship of EP-pH;(C)Effect of PBS concentration on response current

2.5 标准曲线及检出限

在最优条件下，采用差分脉冲伏安法(DPV)考察了黄芩苷的响应峰电流与其浓度的关系。如图5所示，在0.005～10 μmol/L范围内峰电流与其浓度成良好线性关系，线性方程分别为：Ipa=-474.71c-27.686(0.005～0.1 μmol/L)，r=0.9930；Ipa=-14.649c-78.844(0.1～10.0 μmol/L)，r=0.9960。检出限(S/N=3)为0.5 nmol/L，说明rGO -InTAPc纳米复合材料对黄芩苷的测定具有较高的灵敏度。

图5 不同浓度黄芩苷(a→j:0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μmol/L)在PBS(pH=7.0)中的DPV图(插图是黄芩苷浓度与电流之间的关系曲线)Fig.5 DPVs of different concentration of baicalin(a→j:0.005,0.01,0.02,0.05,0.1,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 μmol/L) in PBS(pH=7.0)(The insert was the calibration plot between current and baicalin concentration)

2.6 重现性、稳定性和干扰实验

重现性和稳定性是检测电化学传感器性能的关键，为了考察rGO -InTAPc/GCE修饰电极的重现性，在上述最优实验条件下，平行修饰6根电极，依次放入0.5 μmol/L黄芩苷溶液中进行测定，其测定结果的相对标准偏差(RSD)为1.10%，说明该传感器有良好的重现性。将测定过的修饰电极室温避光保存15 d后再次测定，黄芩苷的响应信号为初始信号的95.29%，说明该传感器具有良好的稳定性。

为了考察rGO -InTAPc传感器对黄芩苷的选择性，对可能共存的干扰物进行了考察。结果表明，500倍浓度的K+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Na+、Cl-、葡萄糖和甘氨酸对黄芩苷测定没有干扰。不同浓度的芦丁对黄芩苷的测定均无显著影响(图6)。说明该传感器对黄芩苷具有良好的选择性，可应用于实际样品中黄芩苷的测定。

图6 芦丁在rGO -InTAPc/GCE修饰电极上对黄芩苷检测选择性的影响(a→f:芦丁浓度依次为0、10.0、25.0、50.0、75.0、100.0 μmol/L)Fig.6 Effect of rutin on rGO -InTAPc/GCE modified electrode for baicalin determination(Rutin concentration:a→f,0,10.0,25.0,50.0,75.0,100.0 μmol/L)

2.7 实际样品的测定

为了考察所建立方法的可行性，对中药制剂银黄颗粒中黄芩苷含量进行测定。取适量待测溶液，用250 mmol/L PBS(pH=7.0)稀释后进行电化学测定，测得该溶液黄芩苷含量为0.054 μmol/L，RSD值为5.19%，计算得银黄颗粒中黄芩苷含量为45.48 mg/g。进一步在该待测液中进行加标回收实验，黄芩苷回收率在96.00%～104.6%之间，RSD值小于3.14%(表1)。同时用HPLC法测定实际样品中黄芩苷含量，测得银黄颗粒中黄芩苷含量为43.50 mg/g。电化学方法与HPLC法测定结果基本一致，证明所制备的传感器对实际样品的测定具有较高的准确性。

表1 实际样品中黄芩苷测定及加标回收率

3 结论

本文通过非共价作用合成了一种可溶性的rGO -InTAPc纳米复合材料，并将其用于黄芩苷电化学传感器的构建。研究了黄芩苷在rGO -InTAPc/GCE上的电化学行为及电化学动力学性质。在最佳实验条件下，黄芩苷响应信号在0.005～10 μmol/L的浓度范围内呈良好的线性关系，检出限为0.5 nmol/L。该传感器可用于银黄颗粒中黄芩苷的快速灵敏测定，为中药制剂的质量控制提供了一种简便有效地检测手段。