基于三柱结构的股骨头坏死病理和显微形态学研究

陈逸炜 缪语 朱斌 刘可心 薛峰 李广翼 张长青

股骨头缺血性坏死(ONFH)是由股骨头血供受损或中断所致。缺血早期出现骨细胞和骨髓成分死亡[1-2]，继而发生软骨下骨折而导致股骨头塌陷，最终导致严重的髋关节疼痛、关节功能障碍[3-4]。我国大规模的流行病学调查显示，非创伤性ONFH患者人数达812万[5]。ONFH潜伏期较长，病情进程较为缓慢，但不及时治疗甚至可导致终身残疾[6]。晚期ONFH患者大多只能选择全髋关节置换术(THA)[7]，这给整个社会带来沉重的经济负担[8-9]。

股骨头形态独特，骨小梁结构复杂且不均匀[10]。股骨头塌陷是影响ONFH预后的关键因素，塌陷后关节软骨和股骨头形态都将受到不可逆破坏，错失保髋治疗的最佳时机[11]。目前主要是根据股骨头坏死灶的位置和大小预测股骨头塌陷风险，基于坏死区分布的三柱分类系统在ONFH相关的基础研究和临床评估中广泛使用[12-13]。该分类系统将股骨头分为3个部分，其中内侧柱、中心柱和外侧柱分别占30%、40%和30%的股骨头。根据坏死灶受累部位，ONFH可分为内侧型（仅累及内侧支柱）、中央型（累及内侧和中央支柱）和外侧型（累及外侧支柱）。该分级方法认为，股骨头外侧柱是股骨头塌陷进展的关键因素[14]。

本研究以主要压力骨小梁（PCT）为标志，将股骨头分为内侧区、中间区和外侧区，探讨不同区域的显微结构和组织形态学特征的差异。微计算机断层扫描(micro-CT)已被用于详细评估股骨头坏死的三维显微结构。然而，既往研究大多只是从股骨近端特定区域中选择性提取小直径的标本[15]，缺少对股骨头整体显微结构的研究。本研究使用micro-CT和脱钙骨组织切片评估股骨头内侧、中间和外侧的骨小梁显微结构和组织病理学改变，旨在加深对ONFH发展过程中显微组织形态学和病理学改变的理解，更准确地评估疾病严重程度，进一步为ONFH治疗方案的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本及资料收集

收集2015年9月至2019年10月于上海交通大学附属第六人民医院因ONFH行THA的股骨头标本，共计23例(男17例，女6例)，按病因分为激素性ONFH（11例）、酒精性ONFH（7例）、创伤性ONFH（3例）、特发性ONFH（2例）。其中右髋12例，左髋11例，平均年龄49.43岁（41～59岁）。所有患者均为国际骨微循环研究协会（ARCO）Ⅲ期[16]。

1.2 标本准备及micro-CT扫描分析

THA后取股骨头标本，保存于-80℃冰箱。然后使用高分辨率micro-CT系统（Scanco Medical，瑞士）进行扫描。通过内置软件对股骨头定位调整，之后进行感兴趣区域分割，测量各区域骨显微结构参数。所有股骨头的方向均以股骨头凹和PCT为解剖标志进行调整（图1）[10,17]。根据坏死病灶的边界，沿上、下方向将股骨头分为坏死区、交界反应区2个主要区域；参照PCT，沿内、中、外侧方向将股骨头分为内侧区、中间区（主要受压小梁区）和外侧区3个主要区域。最终选择6个感兴趣区域：内侧坏死区、中间坏死区、外侧坏死区、内侧交界区、中间交界区和外侧交界区。在每个感兴趣区域中，设置1个圆柱形样本（高度5 mm，直径5 mm）进行显微结构分析（图2、3）。

图1 股骨头不同感兴趣区域的定位和分割 a. 股骨近端冠状位CT图像中黑色虚线中间区域为主要PCT b. 大体切片中黑色虚线中间区域为主要PCT

扫描后得到的图像分别采用Skyscan NRecon、Dataviewer软件重建、调整，之后用 Skyscan CTAn软件对图像进行二值化处理、分析。根据图像灰度直方图分析及经验观察，将矿化骨组织的阈值区间设定为90～255，用以与软组织进行区分[18-20]。然后通过内置软件分析骨组织的三维显微结构。根据X线衰减系数值，制作出彩色图像，其代表小梁内的矿化分布(图2、3)。测量参数：骨体积分数(BV/TV)、骨表面积与体积比(BS/BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁间隙(Tb.Sp)、骨小梁数目(Tb.N)、结构模型指数(SMI)、各向异性度(DA)、连通性密度(Conn.D)[21]。

图2 股骨头坏死区不同位置的micro-CT重建图像 a、b. 外侧坏死区 c、d. 中间坏死区 e、f. 内侧坏死区 注：a、c、e为二维重建图像；b、d、f为三维重建图像

1.3 组织病理学切片

Micro-CT扫描后，将所有股骨头沿冠状面分成前、后两半球。然后从每个股骨头半球中切取10 mm厚的冠状骨组织标本，用于后续组织学检查。所有标本先在4%多聚甲醛溶液中固定2周，然后予以EDTA微波脱钙3周，接着经75%、80%、85%、90%、95%、100%乙醇梯度脱水和二甲苯透明处理，最后石蜡包埋，待后续切片。切片为5 μm厚，行常规 HE 染色，光镜下观察各区域的病理学改变。

图3 股骨头交界区不同位置的micro-CT重建图像 a、b. 外侧交界区 c、d. 中间交界区 e、f. 内侧交界区 注：a、c、e为二维重建图像；b、d、f为三维重建图像

1.4 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。所有数据均以平均数±标准差表示。坏死区和交界区的内侧区、中间区和外侧区之间的比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察

标本的骨组织切片显示，股骨头关节面塌陷。内部结构可分为坏死区、交界反应区和正常区。骨折多出现在软骨下骨区域，可见骨小梁连续性中断，坏死区为淡黄色致密组织,骨小梁形态紊乱；交界反应区可见肉芽组织、纤维组织及硬化的松质骨，部分标本可见囊性变；正常区骨小梁形态规则，方向齐整。

2.2 坏死区骨计量学分析

在坏死区，不同区域的BV/TV、BS/BV、Tb.Th、Tb.Sp、DA、Conn.D无统计学差异（P＞0.05），仅Tb.N、SMI存在统计学差异（P＜0.05）。内侧坏死区Tb.N显著低于中间坏死区和外侧坏死区，内侧坏死区SMI显著高于中间坏死区和外侧坏死区（表1）。

表1 坏死区骨计量学参数分析结果

2.3 交界区骨计量学分析

在交界反应区，不同区域的BV/TV、BS/BV、Tb.Th、SMI存在统计学差异（P＜0.05），而Tb.Sp、Tb.N、DA、Conn.D则无统计学差异（P＞0.05）。内侧交界区的BV/TV显著低于中间交界区和外侧交界区，内侧交界区的BS/BV、SMI显著高于外侧交界区，内侧交界区的Tb.Th显著低于外侧交界区（表2）。

表2 交界区骨计量学参数分析结果

2.4 交界区组织学评估

在交界反应区，可见血管丰富的肉芽组织。单核细胞、淋巴细胞、浆细胞等炎性细胞大量浸润在纤维组织周围，尤其在外侧区域。虽然血管可以穿透纤维化包膜，但在坏死灶边界，血管生成被阻断，修复性纤维血管组织不能穿透坏死区骨髓腔。在疾病中末期，由于成骨细胞活动增强，交界区部分区域新生骨组织增多，尤其是外侧交界区，但这些交界区的成骨活动都无法完全修复坏死的骨组织。与内侧交界区相比，外侧交界区的血管生成也更加丰富(下页图4)。

图4 股骨头标本交界反应区域HE染色观察（从左至右放大倍数分别为×40和×200） a. 内侧坏死区 b. 内侧交界区 c. 中间坏死区d. 中间交界区 e. 外侧坏死区 f. 外侧交界区

3 讨论

在股骨头坏死发生发展的过程中，塌陷是最为重要的病理改变，它的发生是骨修复过程与生物力学共同作用的结果[22-23]。有研究对股骨头坏死标本中的骨小梁进行分析，发现坏死区的BV/TV显著降低；交界反应区的BV/TV增加，骨小梁增粗，结构改变；而正常区的骨小梁结构完整，分布较为均匀[24]。但该研究未对不同部位（内、中、外侧）的坏死区和交界反应区进一步比较分析。在本实验中，我们同时分析了ARCO Ⅲ期的股骨头坏死标本不同区域的显微结构和组织学改变，发现ONFH中坏死区的显微结构相似，而交界反应区的显微结构存在显著区域差异，即与内侧交界区相比，外侧交界区表现出更致密的显微结构。

内、外侧交界区的区域差异性很可能是骨组织内相关细胞对生物应力反应不同所致[25]。在外侧交界区，相较于骨吸收，骨生成活动可能占据主导地位，进而导致外侧区域有更加硬化的显微结构[26]。此外，骨折常发生在坏死区和交界区[23]。这些区域所继发的病理改变如硬化或囊性变等都可能改变生物应力分布[26-27]，同时骨代谢失衡可能通过多种方式促进骨坏死进展，进而导致软骨下骨折发生，最终引起股骨头塌陷[28]。软骨下板骨折常始于交界区附近的骨吸收区[29]。有研究表明，在ONFH早期，等效应力和剪切应力均集中在坏死病灶的外侧边界，同时可见硬化改变[30]；在ONFH晚期，塌陷常发生于外侧边界的软骨下骨[22-23]。当外侧柱受累时，95.3%的股骨头在半年内塌陷[31]，因此有学者认为外侧柱保存是预防股骨头塌陷的关键。

在组织学上，交界反应区是破碎的骨小梁、软骨与修复组织的混合物，包括反应性编织骨、化生性软骨、血管化纤维和肉芽组织[32]。软骨内骨化是骨折端血管化良好时的生理性成骨方式[33]，这在交界反应区也可观察到。Phemister等创造了“爬行替代”一词来表示无菌性死骨的缓慢替代[34]。有研究推测，成骨细胞和破骨细胞活性的改变导致机械强度降低，并最终导致股骨头塌陷[35]。因此，有研究提出可以在早期干预ONFH，促进成骨细胞活性，抑制破骨细胞活性，以防止股骨头塌陷[36]。交界反应区同时发生骨重建[32]：在原位成骨的积累过程中，成骨细胞通常发生在死亡的骨小梁上；破骨吸收过程经常发生在反应界面及其附近。血管生成是坏死后修复反应的重要组成部分[37]。本研究发现，外侧交界区界面的血管生成更加丰富，这表明该部位的修复反应更加活跃。

综上所述，ONFH中坏死区在不同部位表现出相似的显微结构特征，而在交界反应区，外侧交界区存在更致密的显微结构。在组织病理学方面，外侧交界区的血管浸润也更为丰富。本研究有助于更好地理解股骨头坏死不同区域的显微结构及病理组织形态改变，为进一步完善ONFH的诊疗方案提供理论依据。