酶联免疫反应加速仪在HIV抗体筛查试验ELISA法中的应用与探讨

陈晶 昌图县疾病预防控制中心 （辽宁 铁岭 112500）

内容提要： 目的：探讨研究酶联免疫反应加速仪在HIV抗体筛查试验ELISA法中的应用。方法：选取2019年1月～2019年12月在本中心对艾滋病自愿咨询检测的521例人员采集静脉血进行研究，在ELISA法试验中分别酶联免疫反应加速仪和水浴法，以此来探讨酶联免疫反应加速仪在HIV检测中的作用；并以梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）检验结果作为金标准，分析ELISA法在HIV抗体筛查中的效果。结果：本研究结果显示，酶联免疫反应加速仪的灵敏度高于传统水浴法，并且检测时间也短于传统水浴法（P＜0.05）。加速仪法的检出率与水浴法完全一致（P＞0.05）。ELISA检测结果与TPPA结果相比较，准确率为98.84%、灵敏度为85.71%、特异度为99.80%。结论：ELISA法在HIV抗体筛查中准确性较高，且酶联免疫反应加速仪与水浴法能达到一致的检验效果，但是前者大幅度缩短ELISA检测时间，提高了检测灵敏度，提升了工作效率。

艾滋病全称" 获得性免疫缺陷综合征"，是由人类免疫缺陷病毒引起的一种传染病。患者免疫力极度下降，由此引起一系列的感染、肿瘤等恶性病变，甚至导致患者的死亡[1]。艾滋病的潜伏期长，且在发病之前没有明显症状特点，因此患者的治疗时间往往比较偏后，对患者的生命健康安全造成巨大伤害。另一方面，艾滋病在目前尚无可以完全治愈的手段，因此艾滋病的预防与诊断就显得十分重要。随着艾滋病感染人数的逐年增多，各个县级医院也逐步建立起HIV抗体初筛实验室，目前在进行入院检查与输血前检查的必检项目就是HIV抗体筛查，这项艰巨而繁重的工作则由HIV抗体初筛实验室开展[2]。梅毒抗体检测中梅毒螺旋体明胶凝集试验（Treponema Pallidum Particle Assay，TPPA）是金标准，有着较高的特异性、敏感度，有利于非特异性抗体阴性或潜伏期患者诊断，但是TPPA试验反应需要较长的时间，而且检验费用相对较高，不能对结果做自动化判断，所以普及推广受限。ELISA法因为其较为敏感而作为一种初筛方法被初筛实验室首先选用，但是两步法同样会延长检测的时间，工作人员的检测效率也会因此受到不一样的影响。本中心对一台酶联免疫反应加速仪进行引进并将它用于HIV抗体初筛实验中，此仪器能够广泛应用在加速酶联免疫反应。其是利用免疫反应中抗原、抗体结合部分形成互补,凹腔内氨基酸侧键的位置有利于产生多种次级键，同时有序施加的高频电磁波能促使离子迁移以及偶极子转动使得免疫分子振转的原理,进而使酶联免疫反应时间由原本得几十分钟甚至数小时缩短至十分钟内完成。为此，选取2019年1月～2019年12月在本中心对艾滋病自愿咨询检测的521例人员采集静脉血进行研究，将其在使用过程中的检测结果与影响进行分析，具体报告如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

样品：①随机选取2019年1月～2019年12月在本中心对艾滋病自愿咨询检测的521例人员为研究对象，采集每位研究对象的静脉血血清样本进行试验，其中男性体检者353例、女性体检者168例，年龄18～65岁，平均（42.65±7.52）岁。②质控品A和质控品B，由英科新创医药集团有限责任公司提供。

试剂材料：HIV（1+2）型抗体筛查试剂盒，专门用作HIV检测筛查。

仪器材料：NY/MMJ型酶联免疫反应加速仪用于抗体初筛检查；HH-6恒温水浴箱，用于传统水浴法的抗体初筛检测中；KHB科华洗板机；KC-100凯特酶标仪。

1.2 方法

按试剂盒说明书对水浴法进行能够严格操作步骤：①将样本加入37 C水浴箱后静置反应60min；②将酶标抗原加入37 C水浴箱后静置反应30min；③等待37 C水浴箱显色30min。

酶联免疫反应加速仪（加速仪法）用酶联免疫反应加速仪取代水浴法中的37 C水浴箱，每一步的反应时间都有很大的不同。

用生理盐水对质控品进行呈倍比的稀释，再对两种实验方式进行敏感度的对比。

TPPA检测方法：在U型培养板上对待测血清作稀释，产生4种稀释液，比例分别为1:10、1:20、1:40、1:80，在后两种稀释血清中加入未致敏和致敏明胶颗粒，放置2h。阳性标准：U形孔中颗粒呈大环，有外周凝集现象，外缘多形粗糙。

1.3 统计学分析

本研究中计量资料和计数资料均通过统计学软件SPSS22.0进行分析，计量资料表示为±s、计数资料表示为n、%，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 检测结果统计

检测结果显示：酶联免疫反应加速仪法的第一、第二、第三步的反应时间分别为30min、20min、30min，没有与操作说明书的水浴法有明显差异，而其余的反应时间较传统水浴法相比较短；且酶联免疫反应加速仪的检测结果显示加速仪法的灵敏度比水浴法高。

2.2 两种方法检出率比较

结果显示加速仪法的检出率与水浴法完全一致（P＞0.05），见表1。

表1.加速仪法与水浴法对521份血清样本检测结果的统计分析(n)

2.3 ELISA法与TPPA法的诊断效能比较

结果显示：经TPPA检测出7例抗HIV（+）、514例抗HIV（-），阳性率为1.36%（7/521）。ELISA检测出HIV（+）6例、抗HIV（-）515例，阳性率为1.16%（6/521）。以TPPA结果为金标准，ELISA检测的准确率为98.84%（515/521）、灵敏度为85.71%（6/7）、特异度为99.80%（514/515），见表2。

表2.ELISA法与TPPA法的诊断效能比较(n)

3.讨论

艾滋病能够持续对人体的免疫系统造成破坏，最后导致患者的死亡，是一种全球性的重大传染病，艾滋病有极高的病死率与传染性。正是由于艾滋病具有病死率高与传染性强的特点，目前艾滋病已经不完全是医学上所要面临的问题，更是对社会发展的危害。艾滋病的持续传播与增长已经对社会和谐稳定造成了威胁，成为一个严重的社会问题现象，需要各界人群对艾滋病有一个详细认知与高度重视[3]。尤其是在我国当前的发展阶段，由于国内文化与国外文化的发展，冲击传统观念，致使人们的性观念逐渐开放，从而使艾滋病更加快速的传播，艾滋病在日常生活中的影响也越来越严重[4]。由于艾滋病对人体免疫系统的破坏，患者会出现各种罕见的感染性疾病与恶性肿瘤的发病。目前艾滋病还没有完全有效的治疗药物与治疗方案，当感染上艾滋病以后，医护人员也只能通过高效抗病毒药物来对艾滋病病情进行控制缓解，从而让患者的生命得到延长[5]。在这样的情况下，及时的预防与检测艾滋病患病情况就显得尤为重要。

在临床上早期诊断HIV病毒感染中采取血清抗体检测，伴随近几年医疗技术及生物学等多学科持续深入研究，经分子生物学能够予以检验，可见双抗夹心酶联免疫法、化学发光法以及快速金标法等。其中酶联免疫法和胶体硒法属于临床较为多见的检查方法。酶联免疫法则是利用酶催化放大作用来提供抗原抗体反应特异性以及敏感性，其对于检验环境、检验仪器以及操作人员的技术水平要求较高，且需要严格的标准以及操作流程，且需要花费较长的检查时间。胶体硒法属于一种快速检查方法，该方法是经利用胶体硒标记和免疫层析相结合，随后快速固相免疫分析技术对样本血液中HIV抗体予以检测，在此方法中整个检查流程不需要使用任何仪器，具有操作简单的特点，但此种方法的环境温度要求较高，需要保持在25 C左右，若温度较低，则会导致反应较慢，极易产生假阳性。

随着克隆技术的不断完善与发展，ELISA方法更多的应用于临床诊断与医学研究当中，提供了更加准确的数据用于许多疾病的预防、诊断、治疗过程中。ELISA法是以酶联免疫吸附测定法与双抗原夹心法为原理，以梅毒免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）M和IgG混合体为检查对象，重组梅毒螺旋体，让其在血清中有较高的纯度，所以灵敏度和特异度均较高，可以一次性检测多个样本，再以酶标仪为依据，对检测结果进行判断。ELISA的操作对于临床试验的比重也越来越大，增加了许多工作量[6]。所以现在科研人员将目光放在如何将ELISA反应的实验时间缩短、使检测结果的准确性更高等方面，这是目前许多科研人员探讨的重点。酶联免疫反应加速仪利用免疫结合反应中的抗原抗体结合部分作为相互补充，各种次级键能够在凹腔内氨基酸侧键位置迅速得到产生，同时能够将偶极子转动与离子迁移带起免疫分子震动的原理进行有效利用，有效的增加反应体系内抗原抗体分子浓度，解除静态条件下的扩散受限因素，同时震动可使形成的热气流能够使整个板孔有均匀的受热效果，使检测结果的稳定性得到提高[7]。在ELISA的反应过程中，由于反应是通过微量反应板的圆柱形小孔中进行，试剂能够拥有的固定面较大且靠近稳定的固相面，所以有可能造成液相中的配体分子缺失减少，从而导致整个抗原抗体不能顺利到达胞核，这就是限制扩散的原因；同时因为微量反应板上的反应孔是以长方形排列的顺序，表现为四个角的孔乃至四周比中间的孔显色深，这就是临床医学中的边缘效应[8]。

本研究结果显示：酶联免疫反应加速仪法在HIV抗体初筛实验中，第一步反应30min，第二步反应20min为最好的反应时间，显色反应的30min不能进行缩减，这可能是由于在显色反应过程中，抗原抗体不能进行结合，进行反应的只有酶分解底物仍为30min[9]。在抗体初筛检测结果中，两者的检测结果与传统水浴法相一致，并且酶联免疫反应加速仪法的灵敏度更高[10]。另外，在本次研究中将TPPA结果为金标准，经计算ELISA法结果准确率为98.84%、灵敏度为85.71%、特异度为99.80%。充分说明，在HIV抗体筛查中ELISA法准确性较高，而且酶联免疫反应加速仪与水浴法能取得相同水平的试验结果；但是在操作方面，酶联免疫反应加速仪能缩短ELISA检测时间，提升了工作效率。不过本次研究中，有1例TPPA抗HIV（+）患者经ELISA法检查为抗HIV（－），1例TPPA抗HIV（－）患者经ELISA法检查为抗HIV（+），经过分析主要是因为梅毒特异性抗体具有“显现早、消失晚”的特点，结果为阳性仅能表明，受检者受到过梅毒螺旋体感染或正在感染，不能将其作为最终诊断结果[11]；比如患者已经进行了治疗，还是会发现特异性抗体，所以ELISA检测呈阳性，这就出现了误诊情况。因此，ELISA法是首选的HIV初步筛查方法，为了明确诊断建议多种诊断方法综合判断。

综上所述，在确定各步反应最佳时间的情况下，酶联免疫反应加速仪代替传统水浴法进行HIV抗体筛选实验的ELISA法实验中，能够使抗原抗体的灵敏度增加，减少检测的时间，能够在提高灵敏度的同时也让检测的时间缩短，增加检测效率，有效的判读检测结果，让检测的工作效率得到大幅提高。