白细胞介素37 过表达促进急性心肌梗死患者外周血内皮祖细胞的增殖和迁移①

李传荣 赵子明 陈 俭 董加建 崔留义

（郑州市第七人民医院，郑州市心血管病医院心内科，郑州 450000）

世界卫生组织数据显示，心血管疾病在全球均是致死的主要原因。在欧洲，每年有超过400 万人因心血管疾病死亡，约占所有死亡人数的45%，其中冠心病占20%［1］。在美国，2015 年有超过270 万人死于心血管疾病，其中44%死于冠心病［2］。在中国大陆，2015 年冠心病的病死率为110/100 000，且此比例仍在逐年上升［3］。急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是冠心病中最危险和最致命的一种类型［4］。发生AMI后骨髓中的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）会动员至外周血，然后外周血EPCs向缺血心脏归巢并分化为成熟的内皮细胞，启动血管新生过程来修复损伤［5］。已有研究显示，与健康人相比，AMI 患者EPCs 的增殖和迁移能力减弱，提高EPCs的增殖和迁移能力能够改善梗死后的血管新生和心肌功能［6-7］。白细胞介素（interleukin，IL）-37 是重要的抗炎因子，其在冠心病患者血清中表达升高，且表达量与疾病的严重程度呈正相关［8］。但IL-37 与AMI 患者EPCs 的关系目前尚无相关报道。因此，本研究探究IL-37 对AMI患者外周血EPCs 增殖和迁移的影响和可能的分子机制。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 纳入对象 收集2019 年3 月在郑州市第七人民医院新确诊的6 例AMI 患者外周静脉血各10 ml，患者年龄为30～67 岁。患者纳入标准：既往具有冠心病史，冠脉造影检查至少具有1 支冠脉的狭窄程度>50%；具有典型的胸痛史，胸痛至少持续15 min；心电图检查具有2个或2个以上的相邻导联ST 段抬高或压低、出现病理性Q 波；肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白等血清心脏标志物活性较正常值至少增加2倍。排除指标：3周内接受过大手术或受过外伤；心力衰竭和严重的心脏瓣膜疾病；严重的全身性疾病、慢性肾病、肝病、恶性肿瘤、炎症性疾病；既往有精神疾病病史、认知功能障碍。另外收集同期进行体检的年龄、性别和身体质量指数差异均无统计学意义的6例健康志愿者的外周静脉血各10 ml。

1.1.2 主要试剂 Ficoll Paque PLUS 淋巴细胞分离液购自美国GE 公司；胎牛血清、人纤维连接蛋白、青霉素/链霉素、胰蛋白酶购自美国Gibco 公司；内皮细胞培养基购自美国Life technology；CCK-8 试剂盒、ECL 试剂和RIPA 裂解液购自上海碧云天；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、辣根过氧化物酶标记的二抗和1，1'-双十八酯基-3，3，3，3，四甲基-吲哚碳菁高氯酸盐标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-labeled acetylated low-density lipoprotein，DiI-Ac-LDL）购自北京索莱宝科技有限公司；RNAiso plus 购自大连宝生物工程有限公司；HiFiScript 快速去基因组cDNA第一链合成试剂盒和RealSYBR Mixture 试剂盒购自北京康为世纪；Lipofectamine3000 转染试剂、IL-37兔抗人多克隆抗体（1∶1 000）和荧光标记荆豆凝集素Ⅰ［fluorescein-labelled ulex europaeus agglutininⅠ（UEAⅠ），FITC-UEA-Ⅰ］购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）兔多克隆抗体、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）9 兔多克隆抗体、磷酸化Akt（phospho-Akt，p-Akt）兔单克隆抗体、Akt 兔单克隆抗体、磷酸化mTOR（p-mTOR）兔单克隆抗体、mTOR 兔单克隆抗体、磷酸化p70S6K 兔单克隆抗体（p-p70S6K）、p70S6K 兔单克隆抗体、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）兔单克隆抗体和ERK1/2兔单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 EPCs 的分离和培养 根据文献［9］中的方法，从外周血单个核细胞中分离EPCs。使用Ficoll分离液将单个核细胞从AMI 患者和健康志愿者外周静脉血中分离出来。无菌磷酸盐缓冲液洗涤3次后300 g 离心10 min。将收集的细胞接种至包被有10 mg/L人纤维连接蛋白的60 mm 细胞培养皿，加入5 ml 内皮细胞培养基（含5 mmol/L D-葡萄糖、20%胎牛血清、3.0 mg/L 内皮细胞生长补充剂、100 kU/L青霉素和100 mg/L 链霉素）。在37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养4 d，去除未贴壁细胞并换成新鲜的细胞培养液，然后置于细胞培养箱中继续培养，每3 d换1 次培养基。待细胞达到80%左右融合时，胰蛋白酶消化后按1∶3 比例传代。参考文献［10］，用DiI-Ac-LDL 和FITC-UEA-Ⅰ免疫荧光双标鉴定培养的细胞为EPCs。后续实验选择第3～6代细胞。

1.2.2 AMI患者外周血EPCs的分组和处理 将接种后充分贴壁的AMI 患者外周血EPCs 随机分为3 组：对照组、pcDNA3.1 组和IL-37 组。其中对照组不进行任何处理，pcDNA3.1 组和IL-37 组分别使用Lipofectamine3000 试剂转染pcDNA3.1 质粒和构建的pcDNA3.1-IL-37质粒。

1.2.3 细胞活性检测 将2×103个AMI 患者外周血EPCs 接种于96 孔板，待细胞充分贴壁后，根据

1.2.2 方法将细胞分组，分别在转染0 h、24 h、48 h和72 h时每孔加入10µl CCK-8溶液，37 ℃培养2 h。用酶标仪检测各孔吸光度值，波长设置为450 nm。

1.2.4 细胞迁移检测 使用24孔板的Transwell小室进行EPCs 的迁移检测。胰蛋白酶消化未转染或转染pcDNA3.1/pcDNA3.1-IL-37 质粒24 h 的EPCs，并将2×104个细胞接种于上室，加入200µl不含血清的内皮细胞培养基；下室加入600µl 含20%胎牛血清的内皮细胞培养基。在细胞培养箱中孵育48 h，用棉签将膜上表面未迁移的细胞擦去，多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色10 min。显微镜拍摄迁移过膜的细胞，并计算各组细胞数目。

1.2.5 RNA 提取和qRT-PCR 转染72 h 后，按照RNAiso Plus 说明书提取各组细胞总RNA。取1 µg总RNA 去除基因组DNA，逆转录为cDNA。以1 µl cDNA 为模板，设置25 µl qRT-PCR 反应体系：正反向引物各1µl，12.5µl RealSYBR Mixture，ddH2O 补足至25 µl。按照以下程序进行PCR 反应：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火和延伸1 min，共40 个循环。IL-37 正向引物：5'-GCTTAGAAGACCCGGCTGGAAG-3'，反向引物：5'-GCAAAGAA⁃GATCTCTGGGCGTA-3'；MMP9 正向引物：5'-TTC⁃CAAACCTTTGAGGGCGA-3'，反向引物：5'-CTGTA⁃CACGCGAGTGAAGGT-3'。GAPDH 正向引物：5'-CACGGATTTGGTCGTATTGGGC-3'，反向引物：5'-CTGATTTTGGAGGGATCTCGCC-3'。以GAPDH 为内参，使用2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。

1.2.6 Western blot 蛋白检测 收集各组细胞，用含1 mmol/L PMSF 的RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度。取等量各样品总蛋白行SDS-PAGE 分离不同分子量的蛋白，然后转移至PVDF 膜。5%脱脂奶粉封闭2 h 后加入一抗，包括IL-37（1∶1 000）、PCNA（1∶1 000）、MMP9（1∶1 000）、p-Akt（1∶800）、Akt（1∶1 000）、p-mTOR（1∶800）、mTOR（1∶800）、p-p70S6K（1∶800）、p70S6K（1∶800）、p-ERK1/2（1∶1 500）和ERK1/2（1∶1 500），4 ℃过夜孵育，然后加入二抗室温孵育1 h。最后进行ECL显色。Image J 软件分析条带的净光密度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 IL-37 在AMI 患者外周血EPCs 中高表达 荧光显微镜观察所分离培养的细胞，发现细胞呈现出DiI-Ac-LDL 和FITC-UEA-Ⅰ双阳性（图1A），表明成功分离并培养出了EPCs。检测IL-37在健康志愿者和AMI患者外周血EPCs中的表达，结果见图1B、C：与健康志愿者相比，IL-37 mRNA 和蛋白水平在AMI患者EPCs中均升高（P<0.01）。

图1 IL-37在AMI患者外周血EPCs中高表达Fig.1 IL-37 expression was elevated in peripheral blood EPCs in patients with AMI

2.2 IL-37 过表达可促进AMI 患者EPCs 增殖Western blot 结果表明，与对照组相比，IL-37 在IL-37 组中表达升高（P<0.001），在pcDNA3.1 组中表达差异无统计学意义（P>0.05），见图2A、B；与对照组相比，IL-37 组中PCNA 蛋白表达增加（P<0.001），pcDNA3.1组中PCNA 表达差异无统计学意义（P>0.05），见图2A、C。CCK-8 检测细胞活力，结果见图2D，与对照组相比，IL-37 组中细胞活力增加（P<0.01），pcDNA3.1 组中细胞活力差异无统计学意义（P>0.05）。

图2 IL-37过表达可促进AMI患者EPCs增殖Fig.2 IL-37 overexpression promotes proliferation of EPCs from patients with AMI

2.3 IL-37过表达可促进细胞迁移 Transwell检测各组细胞迁移，结果见图3A，与对照组相比，IL-37组中迁移细胞数目增加（P<0.001），pcDNA3.1 组中迁移细胞数目差异无统计学意义（P>0.05）；检测MMP9 蛋白和mRNA 表达，结果见图3B、C，与对照组相比，IL-37 组中MMP9 蛋白和mRNA 表达均上调（P<0.001），pcDNA3.1 组中MMP9 蛋白和mRNA 表达差异无统计学意义（P>0.05）。

图3 IL-37过表达可促进AMI患者EPCs迁移Fig.3 IL-37 overexpression promotes migration of EPCs from patients with AMI

2.4 IL-37过表达对Akt/mTOR 和ERK1/2通路的影响 Western blot 检测Akt/mTOR 和ERK1/2 通路相关蛋白表达，结果如图4 所示：与对照组相比，IL-37组中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 和p-p70S6K/p70S6K均增加（P<0.05 或P<0.01），pcDNA3.1 组中以上指标差异无统计学意义（P>0.05）；与对照组相比，p-ERK1/2/ERK1/2在IL-37组和pcDNA3.1组中差异均无统计学意义（P>0.05）。

图4 IL-37过表达对Akt/mTOR和ERK1/2通路的影响Fig.4 Effect of IL-37 overexpression on activation of Akt/mTOR and ERK1/2 signaling pathways

3 讨论

IL-37是IL-1家族成员，在许多炎症性疾病中发挥抗炎作用［11-12］。IL-37 在动脉粥样硬化斑块中表达增加，过表达IL-37 可减少动脉粥样硬化斑块扩张［13］。研究报道IL-37 在心衰、动脉粥样硬化和急性冠状动脉综合征患者血清中的表达均增加［12］。XU 等［14］的研究显示，在AMI 小鼠中过表达IL-37 可通过减少左室短轴缩短率改善心肌功能。但目前IL-37与AMI患者EPCs的关系尚未见相关报道。本研究发现，与健康志愿者相比，IL-37 在AMI 患者外周血EPCs 中表达上调，表明IL-37 与AMI 患者的EPCs可能存在某种联系。

近年来，心血管疾病的相关研究越来越多的聚焦于EPCs。心血管疾病中EPCs 的增殖和迁移能力受损，因此，如何增加其增殖和迁移能力是治疗心血管疾病的一个重要方向［6，15］。AMI患者EPCs的增殖和迁移能力减弱，因此提高此类型患者EPCs的增殖和迁移能力为AMI 的治疗提供了方向。本研究发现过表达IL-37能增加AMI患者外周血EPCs的细胞活力。PCNA 是协助DNA 复制的DNA 滑动钳家族成员，是细胞增殖的标志物之一［16］。本研究结果显示，过表达IL-37 明显增加了EPCs 中PCNA 的蛋白表达。Transwell 实验发现IL-37 过表达显著增加了EPCs 迁移细胞数目。MMPs 是锌离子依赖的蛋白酶家族，至少包括20 个成员，能够降解所有已知的细胞外基质成分，可调节细胞迁移。MMP9 是MMPs 家族成员，在组织缺血后表达上调，且在缺血条件下可通过促进细胞迁移启始血管生成［17］。本研究进一步探究了IL-37对MMP9表达水平的影响。结果显示IL-37 过表达明显增加了MMP9 mRNA 和蛋白表达，表明IL-37 过表达能增强AMI 患者外周血EPCs的增殖和迁移。

Akt/mTOR和ERK1/2通路被普遍认为是细胞增殖和迁移的启动因子，EPCs的增殖和迁移也与这两条通路的活化有关［15，18-19］。已有研究显示IL-37在肝癌中通过抑制Akt/mTOR 通路从而抑制肝癌细胞生长［20］，但IL-37 通过激活Akt 通路促进骨髓间充质干细胞的成骨分化［21］，表明IL-37 在不同疾病中对Akt通路的作用不同。此外，IL-37 可抑制ERK1/2 通路缓解尘螨诱导的小鼠慢性过敏性哮喘［22］。因此，本研究中进一步探究了IL-37 与Akt/mTOR 和ERK1/2通路的关系。结果显示，IL-37 过表达明显增加了Akt 和mTOR 的磷酸化以及mTOR 下游p70S6K 的磷酸化，但对ERK1/2 的磷酸化水平影响不大。提示在AMI 患者外周血EPCs 中，IL-37 过表达可激活Akt/mTOR通路，但对ERK1/2通路没有影响。总之，本研究表明IL-37 过表达能够增加AMI 患者外周血EPCs 的增殖和迁移，这可能是通过激活Akt/mTOR通路发挥作用的。在探究IL-37 的作用时，本文仅从IL-37 过表达的角度探究了IL-37 对AMI 患者外周血EPCs 增殖和迁移的影响，而未考虑下调IL-37表达的影响，这是本研究的一个不足之处，课题组将对其进行进一步研究。