miR-145与MyoCD调控VSMCs脂质蓄积的研究

龚勇珍，贺卫和，钱荣华，谭 峰，黄小龙 (.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 4008；.湖南中医药大学医学院，湖南 长沙 4008)

动脉粥样硬化(AS)是一种多因素引起的心脑血管疾病，脂质浸润、慢性炎症、血栓形成、内皮损伤、低密度脂蛋白氧化等因素均参与其中，最终导致血管壁硬化及AS斑块形成[1-3]。泡沫细胞的产生是AS斑块最为典型的病理变化，血管平滑肌细胞(VSMCs)和巨噬细胞是泡沫细胞主要来源，特别是AS斑块中50%的泡沫细胞均来自VSMCs[4-5]，说明VSMCs在AS的发生发展过程中起着重要作用。心肌素(MyoCD)是一个强有力促心肌和VSMCs分化的转录共激活因子，在心肌细胞和VSMCs的发育过程中起着重要作用，而且敲除MyoCD会导致小鼠动脉夹层及动脉瘤形成[6]。miR-145定位于染色体5q32，在正常动脉及VSMCs中的表达量最高。研究发现miR-145对于VSMCs表型转化具有显著的调控作用，是VSMCs的表型调节器[7-8]。但通过调控miR-145表达是否影响VSMCs内脂质蓄积报道较少，因此本研究将探讨MyoCD过表达载体联合miR-145 inhibitor转染探讨对VSMCs脂质蓄积情况的影响。

1 资料与方法

1.1实验细胞：人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMCs)购于ATCC(CRL-1999)。

1.2实验试剂与仪器：DMEM完全培养基(KGM12800S，凯基生物)；ox-LDL(S26774，源叶生物)； Trizol试剂、miRNA纯化提取试剂盒、超纯RNA提取试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(CWBIO 康为世纪，批号分别为CW0580S、CW0627S、CW0581M、CW0014S)；miRNA通用SYBR qPCR Master Mix、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(诺唯赞，批号分别为MR101-02、R223-01);2×SYBR Green PCR Master Mix(A4004M，Lifeint 生命互联)；RIPA细胞裂解液(C1053，北京普利莱基因技术有限公司)；超敏发光液(RJ239676，赛默飞)；鼠单克隆抗β-actin、辣根酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(中杉金桥，批号分别为TA-09、ZB-2305、ZB-2301，1/2 000)；兔抗MyoCD (DF2434，Affinity，1/500)；总胆固醇(TC)测定试剂盒(A111-1-1，南京建成)；饱和油红O染色液(G1260，Solarbio)；苏木素染液(AR11800-1，BOSTER)。RT-6100酶标仪(Rayto)； CFX ConnectTM实时荧光PCR仪、Chemi DocTM XRS+超高灵敏度化学发光成像系统[伯乐生命医学产品(上海)有限公司]；DYY-6C蛋白垂直电泳仪(北京市六一仪器厂)；BYC-310药品冷藏柜(山东博科生物)；CX41显微镜(Olympus)。本研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.3实验方法

1.3.1细胞实验分组：①对照组，②MyoCD过表达空载组(NC组)，③MyoCD过表达组，④NC+miR-145 inhibitor组，⑤MyoCD过表达+miR-145 inhibitor组。

1.3.2慢病毒转染MyoCD：当细胞密度达70%时，准备转染；1 ml的细胞培养液里加入1 μl Polybrene助染剂，根据病毒滴度，按MOI为100加入相应的病毒量，37℃培养16 h，更换培养基继续培养48 h。获得MyoCD过表达空载组(NC)和MyoCD过表达组。

1.3.3脂质体转染miR-145 siRNA：慢病毒转染成功后，按照实验分组进行抑制剂转染。当细胞密度达70%时，用不含血清的培养基培养细胞；采用Opti-MEM稀释Lipofectamine 3000及siRNA，二者混匀后室温孵育15 min，转染4 h，换成20%胎牛血清的培养基进行培养。获得NC+miR-145 inhibitor组和MyoCD过表达+miR-145 inhibitor组。miR-145 inhibitor序列如下：5'-AGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC-3'。阴性对照：上游引物5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，下游引物5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。FAM阴性对照：上游引物5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，下游引物5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

1.3.4Western印迹检测转染效果：BCA试剂盒测定标本蛋白浓度，并制定蛋白标准曲线。制作8%浓缩胶及12%分离胶。上样，进行十二烷基苯磺酸钠电泳，湿法转聚偏氟乙烯膜。2%BSA室温封闭1 h，兔抗MyoCD、β-actin多克隆抗体4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L) 室温孵育1 h，加入化学曝光液后，在凝胶成像系统中曝光，并根据Imag J软件分析MyoCD、β-actin电泳条带灰度值。

1.3.5荧光定量PCR检测细胞基因表达水平：按照Trizol试剂盒提取RNA，紫外可见分光光度计测定mRNA浓度和纯度，后根据HiFi Script cDNA 第一链合成试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，在荧光定量PCR仪上进行检测，以GAPDH为内参，计算出各组miR-145-5p、ABCA1和MyoCD mRNA的相对表达量。各引物序列见表1。操作体系: RNase Free dH2O 9.5 μl、cDNA 1 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、2×qPCR混合物2.5 μl。反应程序，三步法：预变性：95℃、10 min，变性：95℃、10 s，退火：58℃、30 s，延伸：72℃、30 s，40个循环。融解曲线分析：95℃、15 s，58℃、1 min，95℃、15 s，58℃、15 s，58℃、15 s，95℃、15 s。

表1 各引物序列

1.3.6脂质蓄积：转染成功后将细胞正常培养基换成含40 mg/L 的ox-LDL培养基孵育细胞，48 h后做油红O染色，ELISA 检测。

2 结果

2.1荧光PCR检测MyoCD过表达载体的转染效率及miR-145干扰效果：与对照组和空载组相比，miR-145-5p inhibitor组miR-145-5p表达明显下降；与对照组相比，MyoCD过表达组MyoCD表达明显升高，验证通过。见图1。

2.2Western印迹验证MyoCD转染效率：MyoCD过表达组与空载组相比，MyoCD表达显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，可知过表达载体转染有效，验证通过。见图2。

A～D：对照组、NC组、miR-145-5p inhibitor组

A～C:对照组、NC组、miR-145-5p组

2.3油红O染色和ELISA检测结果：如图3A所示，为细胞油红O染色结果。各组细胞在ox-LDL孵育48 h后进行染色，脂滴呈红色，细胞核呈蓝色，与对照组相比，实验组细胞内脂滴数量较少，其中MyoCD+miR-145 inhibitor组细胞内脂滴数量最少。图3B所示为ELISA检测各组细胞内胆固醇含量，与对照组相比，其余三个组胆固醇含量明显下降，其中MyoCD+miR-145 inhibitor组胆固醇含量最低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

A～D：对照组、NC组、NC+miR-145 inhibitor组、MyoCD过表达+miR-145 inhibitor组

2.4荧光定量PCR检测结果：与NC组相比，miR-145 inhibitor组和MyoCD过表达对ABCA1的水平无显著影响。见图4。

A～D：对照组、NC组、MyoCD+miR-145 inhibitor组、NC+miR-145 inhibitor组

3 讨论

VSMCs及巨噬细胞是泡沫细胞形成的主要来源，脂质沉积是泡沫细胞形成的关键环节。血管脂质的沉积是AS发生的起始，脂质被氧化后沉积于内膜进而引起血管反应，导致VSMCs迁移及巨噬细胞浸润，继而吞噬大量的脂质。当细胞内蓄积了大量脂质后，泡沫细胞形成，加剧AS的进展[4-5]。因此学者认为通过防止VSMCs内脂质蓄积，可以抑制VSMCs源性泡沫细胞的形成。

2001年Wang等[9]采用BLAST数据搜索小鼠胚胎心脏cDNA文库并克隆出了一个新的蛋白MyoCD，MyoCD基因位于第17号染色体p11.2区，片段长92 kb。MyoCD能够广泛地表达于心肌组织、收缩血管及平滑肌。研究表明MyoCD对于VSMCs增殖、分化及表型转化具有显著的调控作用，并与AS的发生发展密切相关[6,10]。miRNA是一类通过调控靶基因转录的非编码RNA分子，是参与心脑血管疾病、肿瘤等多种疾病的重要调节分子[11]。miR-145定位于染色体5q32，在正常动脉血管及VSMCs中的表达量最高。研究发现miR-145对于VSMCs表型转化具有显著的调控作用，是VSMCs的表型调节器，能够通过靶向调控KLF-4、KLF-5、血管紧张素转换酶的表达，调节VSMCs收缩、分化及功能的恢复，而且增加miR-145表达会导致小鼠斑块增加[12-13]。

本文首先通过PCR检测了MyoCD过表达载体及miR-145 inhibitor转染VSMCs，结果表明相较于对照组，MyoCD过表达组MyoCD mRNA表达量上调，miR-145 inhibitor组miR-145表达量下调，说明转染成功。而且进一步采用Western印迹验证了MyoCD过表达载体转染的成功。接着探讨二者联合转染对于VSMCs内脂质蓄积情况及胆固醇水平的影响，结果表明二者联合能显著的减少VSMCs内脂滴形成及胆固醇水平，从而说明MyoCD过表达联合miR-145 inhibitor能显著的抑制VSMCs内脂质蓄积，可能影响到AS的进展。

ABCA1是一种细胞膜结合蛋白，主要表达于VSMCs、巨噬细胞及内皮细胞，能够通过介导VSMCs内游离胆固醇到到载脂蛋白上形成高密度脂蛋白，是胆固醇逆向转运的第一步骤，因此能够通过维持细胞内胆固醇平衡进而抑制VSMCs内泡沫细胞形成，缓解AS进展[14]。研究表明冠心病AS患者中ABCA1表达水平降低，且体内外实验证实ABCA1减少是导致VSMCs脂质蓄积的重要原因[15]。通过上调ABCA1表达抑制VSMCs内脂质蓄积，进而可以抑制VSMCs源性泡沫细胞形成。因此本研究进一步探讨MyoCD过表达联合miR-145 inhibitor对于VSMCs中ABCA1表达量的影响，结果表明抑制miR-145对ABCA1 mRNA表达无影响。另外，miR-145 inhibitor + MyoCD过表达对ABCA1 mRNA表达无显著影响，可能存在其他机制。

综上所述，MyoCD过表达联合miR-145 inhibitor能显著抑制VSMCs内脂质蓄积。