猪瘟病毒和猪圆环病毒2型混合感染的PCR诊断

李晓丽

承德市动物疫病预防控制中心，河北承德 067000

近年来，随着生猪养殖的迅速发展，规模化猪场疫病呈现出新的特点，主要表现为动物疫病种类多发，多种猪病混合感染状况日趋严重，隐性感染、非典型症状和混合感染越来越普遍，导致发病率和死亡率的增加，给猪病的防控和净化工作带了来巨大的挑战。

猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。当前猪瘟以温和型、非典型猪瘟为主，发病特点为感染时间长、潜伏期长、免疫无效和无季节性[1]。

猪圆环病毒中的PCV2与断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪呼吸道病复合征及猪增生性和坏死性肺炎等[2,3]的发生密切相关，又以对断奶仔猪多系统衰竭综合征的影响最为严重。猪圆环病毒（PCV）2型单独感染症状较轻，但混合感染或免疫刺激后，PCV2的致病性会提高[4]。PCV2可侵害猪的免疫系统，感染后可造成免疫抑制，继发其他细菌和病毒感染，对生猪养殖业会造成巨大的经济损失[5～7]。

以上两种病毒病是严重影响猪群健康和危害猪场生产的主要病毒病[8]。

聚合酶链式反应（PCR）类似于DNA的天然复制过程，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成，具有特异性强、灵敏度高、对标本纯度要求低、简便、快捷等优点，越来越多的应用于动物疫病的诊断。本文通过对一规模猪场病死猪采集血液和组织病料进行实验室检测，确定感染疫病，继而制定有针对性的防控措施。

1 主要临床症状

病猪体温升高到41 ℃，厌食畏寒，体毛杂乱无光泽，皮肤黄染，有的呈丘疹状，指压不褪色，无神经症状，耳部及腹部皮肤呈深红色，会阴部皮下出血，有的甚至出现坏死。

2 病理变化

病猪皮下呈弥漫性出血，淋巴结肿大，腹股沟部淋巴结及肠系膜淋巴结尤为明显，切口呈黑红色。肝脏肿大，表面有不均匀的坏死灶，脾周边有出血性梗死。肺部呈浅红色，伴有局灶性点状出血，气管中有浅粉红色分泌物，膀胱黏膜有大量出血点，心包有少许积液，心脏外膜有点状出血点。

3 实验室PCR检测诊断

3.1 材料和方法

3.1.1 检测样本

无菌采集某规模猪场病死猪全血样本和组织样本（脾脏、淋巴结等）共19份。

3.1.2 主要试剂

非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒购自青岛立见诊断技术发展中心，猪瘟病毒通用型RT-PCR检测试剂盒、猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测试剂盒和猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株和高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR检测试剂盒均购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。磁珠法核酸提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，柱式提取试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。

3.1.3 主要仪器设备

JY96G PCR扩增仪、JY600c核酸电泳仪、JY-04S-3C凝胶成像与分析系统，Roche LightCycler 96荧光定量PCR仪、Tguide S32自动核酸提取仪。

3.1.4 实验方法

按照试剂盒说明书进行样品的前处理、核酸提取及PCR检测。

3.2 检测结果

非洲猪瘟病毒核酸检测呈阴性。

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株和高致病性变异株核酸检测均为阴性。

猪瘟病毒核酸检测结果：按照试剂盒说明书进行核酸产物电泳，选择DNA Marker（100-600bp）作为参照，根据RT-PCR产物电泳结果，阴阳性对照均成立，检测的19份样品中共有13份样品扩增出了猪瘟病毒长度为236 bp的特异性片段，阳性率为68.42%，阳性样品编号为：1、2、3、4、5、6、7、10、11、12、13、14和18。

猪圆环病毒2型核酸检测结果：经荧光定量PCR仪检测，阴阳性对照成立，阴性对照无Ct值及曲线，阳性对照Ct值为23.9，检测的19份样品中有8份样品Ct值均小于等于30，且出现明显的扩增曲线，判为阳性，阳性率为42.10%，阳性样品编号为：1、2、4、5、6、7、13和14。

以上可以看出，有5份样品只感染了猪瘟病毒，猪瘟病毒单一感染阳性率为26.32%，在感染猪瘟病毒的13份样品中，猪圆环病毒2型的感染率达到了61.54%，而感染了猪圆环病毒2型的猪全部感染了猪瘟病毒，猪瘟病毒和猪圆环病毒2型都呈阳性者共8份，混合感染率为42.10%，详细结果见表1和表2。

表1 CSFV和PCV2检测结果

表2 CSFV和PCV2总感染结果

4 分析与讨论

通过病毒核酸检测结果，可以得出如下结论。①该猪场猪瘟病毒阳性率较高，推测导致病猪死亡的主要原因为猪瘟，生猪受猪瘟病毒影响较大；②猪瘟病毒和猪圆环病毒2型混合感染率较高，达到了42.10%，两种病混合感染较为严重；③猪圆环病毒2型单一感染几乎没有，感染了猪圆环病毒的猪均感染了猪瘟病毒，可能与猪圆环病毒造成机体免疫抑制，引起猪体免疫缺陷有关。

养猪场受猪瘟威胁非常大，前些年对生猪实施国家强制免疫后，猪瘟发病率有所下降，但随着猪瘟退出国家强制免疫计划，该病的发病率又呈现了波浪式上升趋势[9]，夏伟等检测结果显示，猪瘟病毒检出率呈逐年升高趋势[10]。猪圆环病毒2型的检出率近年来一直居高不下，由于其属于免疫抑制性疾病，感染后可引起被感染猪的免疫缺陷，大大增加了动物的发病率和死亡率，其高发病率和高死亡率，已逐渐成为研究热点。同时，PCV2灭活疫苗免疫效果不理想，增加成本消耗，在养殖场中未能大面积使用[11]，也是导致其高感染率的原因。

5 防控措施

猪瘟病毒和猪圆环病毒2型均是影响养猪效益的重要疫病，严重威胁猪群健康、降低饲料报酬，对猪场造成重大经济损失。尤其是猪圆环病毒，因其具有免疫抑制功能，感染后可引起猪的免疫缺陷，继发其他细菌或病毒感染，对养猪场的危害更为严重。所以应采取有效的防控措施，有条件的猪场可以开展两种疫病的净化工作，达到消灭传染源，净化疫病的目的。暂时没有条件的猪场可以从以下两个方面加强防控。

5.1 科学制定免疫程序，提高猪群抗病力。现阶段，接种疫苗仍然是防控猪瘟和猪圆环病毒病的有效方法，规模猪场应按程序做好猪瘟、猪圆环等病毒病的免疫工作，同时做好抗体检测工作，发现抗体不合格及时补免。

5.2 加强饲养管理，精准防控。应加强猪场的饲养管理及消毒工作，提高猪群抵抗力，最大限度降低猪群死亡率，减少经济损失，养殖场可以参照非洲猪瘟精准防控措施实施猪场管理。