大蒜硫醚对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的抑制作用

吕 航，可 钦，檀德宏，周 倩，吴朝霞，纪淑娟，白 冰*

（1 沈阳农业大学食品学院 沈阳 110866 2 赤峰学院附属医院 内蒙古赤峰 024005）

大蒜为百合科葱属植物。大蒜不仅是重要的调味品，还具有抗氧化[1-2]、抗菌[3]、抗炎[4-5]、抗癌[6]、抗动脉粥样硬化[7-8]，调节血糖[9]、血脂[10]、降压[11]等功能。研究表明，大蒜的生物活性主要是源自于其含量较高的有机硫化物，目前在大蒜中检测出30多种硫化物[12]。其中大蒜油是一种挥发油，主要由一些挥发性硫化物组成，包括二烯丙基二硫醚（Diallyl Disulfide，DADS）、二烯丙基三硫醚（Diallyl Trisulfide，DATS）[13]。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose 6 Phosphate Dehydrogenase，G6PD）是戊糖磷酸途径的限速酶，可催化D-葡萄糖-6-磷酸氧化为6-磷酸葡萄糖酸内酯。戊糖磷酸途径可提供增殖所需的核苷酸前体和NADPH，在肿瘤细胞增殖过程中，G6PD 的表达都是上调的，以满足肿瘤细胞的生长需要[14-16]。G6PD 在肿瘤细胞中的过表达和活性增加，进一步导致肿瘤组织的快速扩张[17-19]。对G6PD 活性的抑制成为控制肿瘤增殖的一种重要方式，因此对G6PD 抑制剂的研究也日渐增多。类固醇类抑制剂，如脱氢表雄甾酮（DHEA）[20]、表雄甾酮（EA）[21]等被证实可抑制G6PD 活性。来自大蒜的脂溶性硫化物DADS 和DATS 对G6PD 的抑制研究目前鲜有报道。

本研究以大蒜油的主要成分DADS/DATS 为研究对象，利用分子荧光实时监测技术揭示DADS/DATS 对G6PD 的活性具有部分抑制效果。以酶动力学原理分析其抑制类型，采用分子荧光光谱揭示DADS/DATS 对G6PD 的荧光淬灭机制，并分析结合位点数、热力学参数和相互作用力。利用3D 和2D 分子对接技术印证DADS/DATS 对G6PD 的作用力种类和结合方式。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

大蒜（白皮大蒜），沈阳农业大学农贸市场；大蒜油（提取自大蒜），沈阳农业大学食品学院食品化学实验室提供；二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚（优级纯），美国Sigma 公司；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（150 U/mg，微生物来源），上海源叶公司；D-葡萄糖-6-磷酸，上海麦克林公司；氧化型辅酶NAD，北京索莱宝公司；其它试剂均为国产分析纯，国药公司。

7890A-5975C 气相色谱-质谱联用仪，安捷伦科技有限公司；F-4600 分子荧光光谱仪，日本日立公司；紫外可见分光光度计，北京普析通用公司；XMTD-8222 型电热恒温水浴锅，上海精宏公司；FA224 电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；PHS-3C 型pH 计，上海仪电公司；RE-52A型旋转蒸发仪，上海中光仪器仪表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大蒜油的提取 提取方法参照文献，略有改动[22]。新鲜大蒜去皮洗净捣碎，取适量蒜泥，40 ℃pH 6.5 条件下使大蒜内蒜氨酸和蒜氨酸酶充分反应1 h。按料液比1∶4（V/V）加入无水乙醇，40 ℃下超声提取30 min，过滤并浓缩得到大蒜油。

GC-MS 方法参照文献，略有改动[23]：色谱柱：DB-17MS（30 m×0.25 μm）；载气：He（纯度99.999%）；EI 离子源温度：230 ℃；进样口温度：250 ℃；监测器温度：250 ℃；程序升温条件：90 ℃保持1 min，10 ℃/min 速度升温至250 ℃；样品浓度：1 μL/L；进样量：1 μL；不分流模式。

1.2.2 大蒜油、DADS、DATS 对G6PD 活性的影响 通用Tris-HCl 缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.5）。大蒜油/DADS/DATS 经乙醇溶解，分别配制成大蒜油（50～200 μL/mL）、DADS/DATS（1.25～5 mmol/L）。G6PD（0.1 mg/mL）分别与大蒜油/DADS/DATS 以1 ∶1（V/V）混匀，37 ℃水浴30 min，作为酶处理液。

G6PD 酶活测定体系，Tris-HCl 缓冲液400 μL、D-葡萄糖-6-磷酸100 μL（0.03 mg/mL）、NAD溶液20 μL（10 mg/mL），最后加入酶处理液40 μL，加盖摇匀，迅速放入分子荧光光谱仪，激发波长350 nm，每5 s 记录460 nm 荧光强度，连续测定195 s。

1.2.3 DADS、DATS 对G6PD 抑制类型分析 反应体系，Tris-HCl 缓冲液120 μL、D-葡萄糖-6-磷酸50 μL（0.01～0.05 mg/mL），NAD 溶液10 μL（10 mg/mL），最后加入酶处理液20 μL，加盖摇匀，立即监测340 nm 处吸光值。绘制Lineweaver-Burk双倒数图，判定抑制类型。

1.2.4 DADS、DATS 对G6PD 蛋白的荧光淬灭 G6PD（0.5 mg/mL）与DADS/DATS（0～5 mmol/L）等体积混合，分别在298，308，318 K 水浴10 min。取此溶液100 μL，加入Tris-HCl 缓冲液400 μL，加盖摇匀，迅速放入分子荧光光谱仪，激发波长280 nm，扫描290～450 nm 范围的荧光光谱。

1.2.5 荧光淬灭机理分析 结合Stern-Volmer 方程（1），在298，308，318 K 下，以未处理的G6PD的荧光强度（F0）与加入DADS/DATS 后G6PD 的荧光强度（F）的比值对DADS/DATS 浓度（[Q]）作图。

式中：Ksv——淬灭常数；Kq——淬灭速率常数；τ——生物分子的平均荧光寿命（10-8s）。

1.2.6 DADS、DATS 与G6PD 的结合常数和热力学参数 以lg[（F0-F）/F]对lg[Q]作图，根据式（2）可求结合常数（Ka）和结合位点数（n）。

以lnKa对1/T 作图，根据式（3）可求焓变ΔH、熵变ΔS，由式（4）可求吉布斯自由能变ΔG。

1.2.7 分子对接技术 G6PD 晶体结构取自PDB蛋白数据库（PDBID：2BHL），DADS、DATS 的分子结构来自ZINC 数据库（1531082，1633229）。利用软件Autodock4.2 进行分子对接，使用拉马克遗传算法，选择自由能最低的结合模式分析，利用PYMOL 和LIGPLOT 软件导出结果。

2 结果与分析

2.1 大蒜油的GC-MS 分析

图1为大蒜油的总离子流图和质谱图，主要包含2 种硫醚：DADS（图1c 峰1）、DATS（图1c 峰2）。DADS、DATS 保留时间分别为4.9，6.8 min。图1a 和图1b 分别为保留时间4.9，6.8 min 时的质谱图，质谱图中出现了质量/电荷比（m/z）为41，73，113，146，178 的主要碎片，m/z 41 对应CH2=CHCH2-，m/z 73 对应CH2=CH-CH2-S-。146（Ma）和178（Mb） 分别为DADS（C6H10S2，146） 和DATS（C6H10S3，178）的分子离子碎片。

图1 大蒜油总离子流图（TIC）（c）及DADS（a）、DATS（b）的质谱图（MS）Fig.1 Total ion current chromatogram（TIC）（c） and mass spectrum（MS） of DADS（a），DATS（b）

2.2 大蒜油/DADS/DATS 对G6PD 活性抑制作用

如图2a～2c 所示，利用分子荧光光谱仪实时监测了大蒜油对G6PD 活性的影响，荧光强度与酶活成正比，发现50～200 μL/mL 的大蒜油具有部分抑制G6PD 活性作用。进一步考察大蒜油主要成分DADS/DATS 对G6PD 活性的影响，1.25～5 mmol/L 的DADS/DATS 均具有抑制G6PD 活性的作用，且呈浓度依赖关系。

图2 不同浓度的大蒜油（a）、DADS（b）、DATS（c）对G6PD 活性影响Fig.2 Impact on G6PD activity of different concentrations of garlic oil（a），DADS（b），DATS（c）

2.3 DADS/DATS 对G6PD 的抑制类型

Lineweaver-Burk 双倒数曲线，如图3a 和3b，在反应体系中加入不同浓度的DADS/DATS 后得到一簇斜率不同，交于第二象限的直线。交点未落在X 轴（非竞争性抑制）或者Y 轴（竞争性抑制），判断DADS/DATS 对G6PD 的抑制类型为可逆抑制中的混合性抑制，即兼具竞争性抑制和非竞争性抑制。说明DADS/DATS 可通过两种方式对G6PD 产生抑制：一种方式是与底物竞争G6PD 的结合位点产生竞争性抑制，另一种方式是和G6PD的非活性部位结合形成复合物产生非竞争性抑制。

图3 DADS（a）/DATS（b）对G6PD 抑制的Lineweaver-Burk 图Fig.3 Lineweaver-Burk plots for G6PD inhibition types of DADS（a）/DATS（b）

2.4 DADS/DATS 对G6PD 的荧光淬灭

图4a 和4b 为298 K 时不同浓度的DADS/DATS 作用下的G6PD 的荧光光谱，随着DADS/DATS 浓度（0～5 mmol/L）的增大，333 nm 处G6PD蛋白的荧光强度逐步降低，说明DADS/DATS 与G6PD 蛋白产生了相互作用，导致了荧光的淬灭。

图4 不同浓度的DADS（a）/DATS（b）作用下的G6PD 荧光光谱Fig.4 Fluorescence spectra of G6PD with different concentrations of DADS（a）/DATS（b）

2.5 DADS/DATS 对G6PD 的荧光淬灭机理

荧光淬灭分为动态淬灭和静态淬灭，为判断其淬灭类型，分别在298，308，318 K 3 个温度下，以F0/F 对[Q]（方程式1）作图，绘制Stern-Volmer曲线，如图5a 和5b。由曲线的斜率可求Ksv和Kq，列于表1。对于DADS/DATS 而言，随着温度的升高，Ksv值减小，且Kq值均大于淬灭剂对大分子物质的最大碰撞速率常数2×1010mol/L/s。因此，DADS/DATS 对G6PD 蛋白的荧光淬灭属于静态淬灭。

表1 不同温度下DADS/DATS 与G6PD相互作用的KSV 和Kq 值Table 1 KSV and Kq values of the interaction between DADS/DATS and G6PD at different temperatures

图5 不同温度下DADS（a）/DATS（b）与G6PD 相互作用的Stern-Volmer 曲线Fig.5 Stern-Volmer curves of the interaction between DADS（a）/DATS（b） and G6PD at different temperatures

2.6 DADS/DATS 与G6PD 相互作用的结合常数和结合位点数

分别在298，308，318 K 3 个温度下，以lg[（F0-F）/F]对lg[Q]（方程式2）作图，如图6a 和6b。通过曲线截距和斜率可求DADS/DATS 与G6PD的结合常数Ka和结合位点数n，如表2。所有n 值均接近于1，说明DADS/DATS 和G6PD 之间存在一个结合位点。在308，318 K 时，DADS 的Ka值大于DATS 的Ka值，说明在308，318 K 时，DADS 与G6PD 之间的结合力较强。

图6 不同温度下DADS（a）/DATS（b）与G6PD 相互作用的双对数曲线Fig.6 Double logarithmic curves of the interaction between DADS（a）/DATS（b）and G6PD at different temperatures

表2 不同温度下DADS/DATS 与G6PD相互作用的Ka 和n 值Table 2 Ka and n values of the interaction between DADS/DATS and G6PD at different temperatures

2.7 DADS/DATS 与G6PD 相互作用的热力学参数和作用力

淬灭剂小分子与生物大分子之间可通过氢键、静电作用力、疏水相互作用和范德华力等相互作用。可通过反应的焓变ΔH、熵变ΔS、吉布斯自由能变ΔG 来判断作用力类型。以lnKa对1/T（方程式3）作图，如图7a 和7b。可通过曲线斜率和截距求出ΔH 和ΔS，再根据热力学方程（方程式4）可求ΔG，热力学参数列于表3。对于DADS，ΔH＞0，且ΔS＞0，说明DADS 和G6PD 主要是通过疏水相互作用结合的；对于DATS，ΔH＜0，且ΔS＜0，说明DATS 和G6PD 主要是通过氢键和范德华力结合的。ΔG 值均小于0，说明DADS/DATS 与G6PD 相互作用都是自发进行的。

表3 不同温度下DADS/DATS 与G6PD作用的热力学参数Table 3 Thermodynamic parameters of the interration between DADS/DATS and G6PD at different temperatures

图7 不同温度下DADS（a）/DATS（b）与G6PD 相互作用的Van't Hoff 曲线Fig.7 Van't Hoff curves of the interaction between DADS（a）/DATS（b） and G6PD at different temperatures

2.8 DADS/DATS 与G6PD 蛋白的分子对接

进一步利用分子对接技术解释DADS/DATS与G6PD 的相互作用机制。在对接结果中选择结合能最低的构象作为最优，进一步分析相互作用机制。结果表明DADS 和DATS 均可进入G6PD分子内部。其中DADS 与G6PD 结合能为-2.69 kcal/mol，结合性能较好，见表4。

表4 DADS/DATS 与G6PD 蛋白分子对接的结合能Table 4 The binding energies of the docking of DADS/DATS and G6PD

DADS 与G6PD 结合的3D 图和2D 图，如图8a 和8b，揭示出DADS 与G6PD 蛋白结合位点周围存在多个贡献较大的氨基酸残基。Ala-377、Val-376、Phe-216、Gly-222、Phe-221、Pro-223 等疏水性氨基酸残基可通过疏水作用与DADS 结合，Arg-219、Asn-218、Lys-275、Arg-215、Trp-225等极性氨基酸残基可通过静电吸引与DADS 结合。

图8c 和8d 分别是DATS 与G6PD 结合的3D图和2D 图。同样地，Phe-253、Gly-254、Ala-335、Ile-472、Ile-255、Leu-469、Leu-305 等疏水性氨基酸残基与Arg-175、Lys-476、Arg-257、Thr-334、Thr-333、Glu-473 等极性氨基酸残基，分别对DATS 形成疏水作用和静电吸引；且Phe235 还可与DATS 中心位置的S 形成氢键，键长为3.2Å，作用力以氢键为主。这些结果与热力学分析表明的DADS/DATS 和G6PD 相互作用的结论相吻合。因此，DADS 与G6PD 通过疏水作用和静电吸引等方式实现相互作用的，以疏水相互作用为主；DATS与G6PD 通过疏水作用、静电吸引、氢键等方式实现相互作用，以氢键为主，进而实现DADS/DATS对G6PD 活性的抑制。

图8 DADS 和DATS 分别与G6PD 相互作用的分子对接图Fig.8 Molecular docking of G6PD interacted with DADS and DATS

3 结论

本研究从大蒜中提取了大蒜油并通过酶活实时监测、酶动力学分析、荧光光谱法以及分子对接等技术研究了DADS/DATS 与G6PD 蛋白的相互作用机制。结果表明，DADS/DATS 均可部分抑制G6PD 的活性，且该抑制作用属于混合性抑制；DADS/DATS 均可使G6PD 蛋白产生内源荧光淬灭，且为静态淬灭；分子荧光光谱和3D/2D 分子对接技术共同揭示了DADS 与G6PD 以疏水作用和静电力相互作用，且以疏水作用为主，DATS 与G6PD 蛋白以疏水作用、静电力和氢键相互作用，且以氢键为主。