单纯性肥胖者DC负载结核Th优势表位肽后的免疫功能改变探究

黄新亮，伍云云，董博翰

(皖南医学院基础医学院，安徽 芜湖 241002)

目前采用体质量指数(BMI)即体重(千克)除以身高(米)的平方定义是否肥胖，在中国BMI分组方法：正常体重为18.5≤BMI<24 kg/m2，超重为24≤BMI<28 kg/m2，肥胖定义为BMI≥28 kg/m2。单纯性肥胖症是指无器质性疾病或无引起肥胖的特殊病因的肥胖症。近年肥胖症在全球的发病率呈现逐年上升趋势，我国是世界上肥胖者最多的国家[1-2]。已知巨噬细胞在人体免疫的第一道防线中起重要作用。有研究者阐释这些来源于巨噬细胞的炎症过程是导致脂肪组织改变的原因，是肥胖、心血管疾病、脂肪肝和2型糖尿病相关的代谢综合征的根源。而且控制组织功能的消炎性巨噬细胞(M2)能转化成促炎性巨噬细胞(M1)，于是M2/M1巨噬细胞数量之间的平衡对于肥胖的产生至关重要[3]。再者，外泌体是细胞分泌的一种囊泡样小体，有研究发现外泌体中特定的miRNAs通过调控经典棕色脂肪组织的功能及白色脂肪组织褐变的形成，以及参与脂肪组织中巨噬细胞的活化和分化，在肥胖症的病理形成过程中产生了关键作用。因而根据减肥手术后外泌体miRNA谱的细微变化，分离并纯化肥胖症患者的自身外泌体，或可成为治疗肥胖的新方法[4]。

已有研究显示，肥胖者不仅可伴随有高血压、高胆固醇及某些肿瘤外，还可影响机体的非特异性免疫及特异性免疫功能，使体液免疫和细胞免疫功能发生改变，从而使病原菌感染的机会增多。且发现降低体重常常能逆转肥胖症患者的免疫功能。目前认为瘦素可能是一重要的影响内分泌系统及其与免疫系统之间的相互作用的关键因素[5]。在肥胖小鼠脂肪组织中发现某些NKT细胞亚群功能改变与M1型极化的增强可能存在密切关系、可能参与了肥胖小鼠脂肪组织慢性炎症的进展[6]。

综上，巨噬细胞在肥胖症的调节中也起着关键作用，但其它免疫细胞与巨噬细胞如何相互作用尚不明确。再者肥胖者对抗原的免疫应答过程是否存在异常仍不清楚。基于此，本研究拟探究单纯性肥胖症的特异性免疫功能是否下降、是否存在病理性免疫应答所致炎症反应。以结核杆菌Th优势表位肽为例刺激DC并诱导免疫反应[结核杆菌抗原Rv0934(350-364)的表位肽DQVHFQPLPPAVVKL，能激发更强大的Th免疫效应，成为Th优势表位肽[7]]，设置肥胖组、健康组、空白组。对肥胖组和健康组以DC负载结核杆菌的Th优势表位肽后制备DC疫苗，而空白组以DC对照，以流式仪鉴定DC的成熟度；各组DC和自身淋巴细胞混合后流式仪鉴定表达活化分子ICOS的淋巴细胞、效应CD4+T及CD8+T；并以酶联免疫吸附法检测Th产生的效应细胞因子IFN-γ、LDH法检测CTL的细胞毒效应。

1 对象与方法

1.1 对象 健康组为志愿者7例，经健康体检符合正常体重18.5≤BMI<24 kg/m2。空白组和肥胖组分别为6例和13例，无其他发病史，符合我国肥胖定义的 BMI≥28 kg/m2。三组年龄及性别差异均无统计学意义。

1.2 试剂 外周静脉血，巨噬细胞、无血清AIM-V培养液，DC表面标志分子CD83、CD11c及CD86的荧光素PE标记抗、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-1b、IL-6、GM-CSF、FITC荧光素标记抗人CD3单克隆抗体和PE标记的抗人CD8、CD4、ICOS单克隆抗体(Biolegend公司)，检测INF-r的ELISA试剂盒、优势表位肽DQVHFQPLPPAVVKL(武汉强耀生物科技有限公司合成)。

1.3 方法

1.3.1 制备DC疫苗 肥胖组和健康组分离人外周血单个核细胞并置于4孔板中，在37 ℃、含5% CO2的培养箱中培养3 h；6孔板中贴壁的为DC(收集未贴壁的细胞并且冻存，以便后期和DC混合培养)。向6孔板中加入100 ng/mL GM-CSF、100 ng/mL IL-4，加3毫升/孔无血清AIM-V培液。第3天DC中加入Th优势表位肽(10 μg/mL)并加入：TNF-a 10 ng/mL、IL-1b 10 ng/mL、IL-6 1000 U/mL。观察DC形态变化，收集第8天的DC并采用流式细胞仪检测各组DC表面标志分子CD83、CD11c及CD86。空白组以DC为对照。

1.3.2 T细胞的活化与鉴定 各组DC计数，以1×106/mL作为刺激细胞，按DC∶T细胞=1∶20的比例，和复苏冻存的初始T细胞混合，37 ℃置于5% CO2的培养箱中培养，4 d后收集活化的T细胞。流式细胞仪检测各组表达活化分子ICOS的T细胞百分率。

1.3.3 T细胞的分化与鉴定 检测各组CD4+T和CD8+T细胞百分率：在每孔100 μLPBMC细胞悬液中，加入5 μL PE标记的抗人CD3克隆抗体、5 μL FITC标记抗人CD4或CD8单克隆抗体，4 ℃避光染色30 min，以流式细胞仪C6检测。

1.3.4 Th效应的细胞因子INF-γ的检测 按照ELISA检测试剂盒说明，于波长450 nm的酶标仪上读取各孔的A值，采用吸光度A值为纵坐标(Y)、标准品浓度为横坐标(X)，得到相应的曲线，样品的INF-γ水平可依据A值由标准曲线换算成相应的浓度。

1.3.5 特异性CTL细胞毒效应检测 以乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)法检测各组细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的杀伤活性，靶细胞为巨噬细胞，效靶比为1∶20。CTL杀伤活性=(效靶混合细胞释放A值-自然释放A值)/(最大释放A值-自然释放A值)。

2 结果

2.1 各组表达CD11c、CD83、CD86的DC百分率 肥胖组表达CD11c、CD83、CD86的DC百分率均明显高于空白组和健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1和表1。

图1 流式细胞仪检测各组表达CD11c、CD83、CD86的DC百分率

表1 各组表达CD11c、CD83、CD86的DC百分率 单位：%

2.2 各组表达ICOS活化分子的T细胞百分率 肥胖组表达ICOS活化标志分子的T细胞百分率均明显高于空白组和健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组表达ICOS活化分子的T细胞百分率 单位：%

2.3 各组T细胞分化的效应CD4+T和CD8+T的比率 肥胖组表达CD4+T和CD8+T的比率均明显高于空白组和健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组表达CD4+T和CD8+T的比率 单位：%

2.4 各组Th产生INF-γ的水平比较 肥胖组Th产生的INF-γ水平均明显高于空白组和健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组Th产生INF-γ的水平比较 单位：μg/L

2.5 各组CTL的细胞毒效应 肥胖组CTL杀伤活性的百分率明显低于健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 各组CTL的细胞毒效应 单位：%

3 讨论

单纯性肥胖症患者Th与巨噬细胞之间或存在反馈性调节，致使免疫性炎症发生。一方面，M1细胞产生的细胞因子如对肥胖症患者的Th免疫功能产生正调节。如当巨噬细胞受到炎症刺激时，它们会分泌细胞因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和肿瘤坏死因子(TNF)。加上由活化的淋巴细胞、内皮细胞和成纤维细胞产生也可产生这些细胞因子，使肥胖症者的Th功能加强。另一方面，Th产生的IFN-γ对M1细胞起到激活作用。本研究亦发现肥胖组Th产生IFN-γ的水平分别比空白组和健康组显著升高。当肥胖症者在后天生活中不断接触多样性抗原亦会使M1细胞功能持续性升高。已知巨噬细胞还会释放趋化因子、白三烯和前列腺素等促炎细胞因子，这会促使血管通透性增加和炎症细胞的募集，除了局部效应外这些炎症介质还产生全身效应，如诱导急性炎症反应蛋白的产生和发热反应。

有研究者发现[8]，脾脏巨噬细胞与树突状细胞存在相互作用。巨噬细胞可以分子黏附或分泌外泌体的方式传递自身包含的抗原至DC，后再由DC递呈抗原给其特异性T细胞，诱导免疫应答。其中组织定居性巨噬细胞能够吞噬颗粒、病原菌、死亡的细胞及外泌体等抗原，通过细胞因子与趋化因子的产生启动免疫应答。这些组织定居性巨噬细胞若在受到损伤、感染和炎症时，可由骨髓产生的单核细胞来补充。此外，也有研究者[9]已证实小鼠脾脏DC与巨噬细胞共培养时，各自的抗原提呈能力都比单独培养时增强。例如脾脏巨噬细胞吞噬死细胞相关抗原之后，以神经酰胺依赖的方式释放包含抗原的外泌体。而DC吞噬此类外泌体后把抗原提呈给特异性CD4+T细胞。两类细胞可能借助外泌体进行抗原的交换致使各自的免疫应答能力增强。肥胖症者免疫功能低下与短寿、感染关系密切，如人群幽门螺杆菌感染与超重及肥胖密切相关[10]。因生活水平的提高及伴随而来的饮食习惯的改变，全球肥胖人数在不断升高，肥胖亦是导致多种肿瘤恶化的重要因素。推测肥胖者体内积累的脂肪能增加雌激素的合成与分泌，与多种妇科恶性肿瘤发生有关[11]。也有研究表明在2005—2014年期，除结直肠癌外，超重和肥胖相关癌症的发病率在年龄20～74岁之间的人群显著增加[12]。本研究也发现肥胖组CTL的细胞毒效应比健康组明显下降，肥胖症者是否存在自身免疫疾病仍需求证。当肥胖症者特异性免疫功能下降，体内的抗原可能逐渐堆积造成免疫忽视的打破，以死亡细胞积聚为特征的自身免疫性疾病的免疫反应机制不能忽略。例如发现自身免疫性甲状腺功能减退患者的肥胖及脂代谢明显紊乱，部分患者自身免疫损伤程度[13]。也发现中老年糖尿病患者中胰岛细胞的自身免疫时常发生，其自身免疫反应以抗体的单阳性为主要特征[14]。研究者发现体重指数增加可导致甲状腺功能正常者的血清促甲状腺激素浓度增高、游离甲状腺激素略降低[15]。有研究者研究肥胖儿童发生的阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征 (OSAHS)，发现IL-10抗炎的减弱可能是导致肥胖儿童发生OSAHS重要因素[16]。

本研究发现，单纯性肥胖者DC负载结核杆菌的Th优势表位肽后，DC成熟度及提呈抗原功能比健康组增强，且诱导的活化的自身淋巴细胞及分化的效应CD4+T和CD8+T增多，其诱导产生的细胞因子IFN-γ水平上升。而肥胖组CTL的细胞毒效应比健康组明显下降，但肥胖症者在后天生活中不断接触多样性的抗原，本研究仅以结核Th优势表位肽诱导免疫细胞为例探究肥胖症形成过程中的免疫功能改变的机制。再者，虽然实验中各组的年龄及性别差异均无统计学意义，但单纯性肥胖症的诱发因素具有多样性和不确定性，这些因素如何作用于肥胖症患者，需要今后深入探讨，以便为制定肥胖症的量化运动处方提供精准方案[17]。