抗NMDA受体脑炎相关癫痫小鼠脑组织小胶质细胞及IL-1β、TNF-α表达的变化

叶霖，黄虹蜜，吴莹，杨升煜，李偲俊，罗小丹，马美刚，吴原

随着抗体检测的普及，临床上证明，自身免疫性癫痫(autoimmune epilepsy，AE)在癫痫中占相当一部分比例，对抗癫痫药物不敏感的患者，免疫疗法可能有效，说明这种癫痫与自身免疫性疾病相关。2017年国际抗癫痫联盟(ILAE)对AE的定义是:它直接由一种免疫性疾病引起，并且癫痫发作是这种疾病的核心症状。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体抗体是AE最常见的神经特异性抗体之一，所致癫痫发作的临床表现复杂多样，癫痫发作的预后与患者免疫反应进程存在密切联系。

小胶质细胞作为中枢神经系统的主要免疫细胞，在发育期和成年期的神经回路的发展和维护中与神经元形成、存活及吞噬有着密切的关系。小胶质细胞的激活是一个动态变化的过程，在癫痫的发生发展中起重要作用。越来越多的证据表明，小胶质细胞在中枢神经系统的激活可分为2种相反的类型：M1型和M2型。根据激活的表型，小胶质细胞可以产生细胞毒性或神经保护作用。但对癫痫和(或)癫痫发作过程中的这种小胶质细胞的研究不多。本研究参照文献[7]的造模方法，以NMDA受体抗体介导的AE小鼠为研究对象，观察癫痫发作情况并探索M1/M2型小胶质细胞的活化和相关炎症因子TNF-α、IL-1β的表达变化。

1 材料与方法

1.1 动物来源

选取健康清洁级成年雄性C57BL/6J小鼠共17只，8周龄，体质量约18～22 g，饲养环境温度为(21±1)°C，湿度(55±10)%，周围光线明暗周期为12 h交替进行(光期：晚上7点到早上7点)，食物和水源供应充足。C57BL/6J小鼠由广西医科大学动物实验中心提供，实验过程均按动物研究伦理学要求进行。

1.2 主要仪器及试剂

合成肽GluN1359-378(购于卓一生物);结核分枝杆菌H37Ra(购于BDDS);完全弗氏佐剂(购于Sigma Aldrich Laboratory);小鼠TNF-α、IL-1β酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(购于Boster Biological Technology)；兔抗鼠IBA-1单克隆抗体(购于Sigma Aldrich Laboratory); 兔抗鼠Arg1单克隆抗体(购于Boster Biological Technology); 兔抗INOS单克隆抗体(购于Boster Biological Technology); 兔抗鼠p-p38单克隆抗体(购于Boster Biological Technology); 兔抗鼠GADPH单克隆抗体(购于Sigma Aldrich Laboratory)。

1.3 方法

1.3.1 动物分组

小鼠随机分为2组：抗NMDA受体脑炎相关癫痫组(11只，模型组);正常对照组(6只)。模型组8周龄雄性C57BL/6J小鼠皮下注射200 μg多肽GluN1359-378(溶于100 μL PBS溶液)与含有600 μg结核分枝杆菌H37Ra的完全弗氏佐剂乳剂混合物，体积比1∶1，该乳剂分4次注射到四肢，每次50 μL,诱导自身免疫应答。所有模型组小鼠在免疫时和免疫后48 h，腹腔注射含有200 ng百日咳杆菌毒素的200 μL生理盐水。免疫2周后，模型组小鼠腹腔注射戊四氮(PTZ)50 mg/kg。对照组用同等剂量生理盐水代替乳剂、百日咳杆菌毒素和PTZ。

1.3.2 动物行为学观察

观察记录小鼠体质量及痫性发作情况。根据Racine分级标准:0 级为无惊厥；Ⅰ级为面部阵挛；Ⅱ级为面部阵挛+节律性点头；Ⅲ级为面部阵挛+节律性点头+前肢阵挛；Ⅳ级为面部阵挛+节律性点头+前肢阵挛+后肢站立；Ⅴ级为面部阵挛+节律性点头+前肢阵挛+后肢站立+跌倒。根据Racine分级，选择Ⅳ-Ⅴ级致痫小鼠作为癫痫模型组。

1.3.3 海马神经元细胞形态变化

小鼠断头取脑，以4%(质量浓度)多聚甲醛固定24 h,石蜡包埋，切片(片厚4 μm)，二甲苯透明、酒精脱水，Nissl染色液37 ℃染色30 min,水洗，风干，二甲苯透明，中性树胶封片，置显微镜下观察神经元形态。

1.3.4 海马组织中TNF-α、IL-1β测定

取3只小鼠断头取脑，快速剥离海马组织，该操作于冰面上完成，置于-80℃冰箱储存待用。提取海马组织蛋白后，按ELISA试剂盒操作说明分别测量海马组织中IL-1β及TNF-α细胞因子水平。

1.3.5 Western blot检测海马组织中IBA-1、Arg-1、iNOS 蛋白的表达水平

各组取适量海马组织于高效RIPA蛋白裂解液和PMSF混合液中充分裂解30 min提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加Loading Buffer煮沸后取25 ug蛋白上样，SDS-PAGE分离转移至NC膜，快速封闭液室温封闭20 min，加入相应的一抗置于4℃冰箱过夜，次日TBST洗膜后加入带HRP荧光标记山羊抗兔二抗(1∶10 000)于室温孵育1 h，TBST洗膜后系统成像，以Image J软件分析条带灰度值，计算目的蛋白与内参蛋白GAPDH的比值以及各组目的蛋白条带的比值，进行定量分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件作统计学分析，Graph Pad Prism 5对数据进行作图，数据以均数±标准差表示，采用单因素方差(one-way ANOVA)分析组间差异，

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物行为学观察

第7天和第14天对照组和模型组小鼠体质量比较差异无统计学意义 (第7天:

t

=0.682，

P

>0.05；第14天：

t

=-0.624，

P

>0.05)。结果详见表1。对照组小鼠未见自发的癫痫痫性症状发作，第14天脑电图(EEG)以不规则基础波为主(图1)。第14天模型组小鼠有出现咀嚼、点头的痫性症状，EEG监测可见散在的痫性波(图1)。第14天模型组注射PTZ后11只小鼠均出现Ⅳ级以上发作，发作率为100%，死亡4只，死亡率为36%。

表1 对照组与模型组小鼠第7天、第14天体质量比较(=6，/g)

组别第7天第14天对照组模型组0.57±0.200.25±0.770.30±0.660.58±0.64

图1 第14天两组小鼠的EEG表现

2.2 海马神经元细胞形态和存活的变化

对照组小鼠海马CA1、CA2及DG区可见神经元排列整齐，形态规则完整，染色质分布均匀；尼氏染色均匀。与对照组比较，模型组小鼠海马CA1、CA2及DG区尼氏染色均出现减弱，部分神经元细胞变性坏死，细胞形态不完整，细胞肿胀或皱缩，轮廓模糊，界限不清；细胞间距增加，排列疏松紊乱(图2)。

图2 两组小鼠海马组织CA1、CA2及DG区神经元存活情况(Nissl染色,×200)

2.3 对照组与模型组海马组织中炎性因子TNF-α、IL-1β的比较

与对照组比较，模型组小鼠海马组织中IL-1β、TNF-α因子均显著增高，差异有统计学意义(

t

=-3.58，

P

<0.05)。结果详表2。

表2 小鼠海马组织中TNF-α及IL-1β的表达情况[=3,/(pg/mL)]

组别TNF-αIL-1β对照组60.77±7.10135.70±5.93模型组97.40±14.15227.20±32.52

2.4 对照组与模型组海马组织中IBA-1、Arg-1、iNOS蛋白水平的比较

与对照组比较，模型组小鼠的海马组织中，IBA-1、iNOS显著增高，差异有统计学意义(IBA-1：

t

=-4.85，

P

<0.05；iNOS：

t

=-3.00，

P

<0.05)，p-p38减少，差异有统计学意义(

t

=2.93，

P

<0.05)，Arg-1减少，差异无统计学意义(

t

=-2.40；

P

>0.05，图3)。

注：A为Western Blot检查两组小鼠海马组织IBA-1、Arg-1、iNOS蛋白的表达水平，B为两组小鼠海马组织IBA-1、Arg-1、iNOS蛋白相对表达量的统计分析。图3 两组小鼠海马组织中IBA-1、Arg-1及iNOS蛋白水平

3 讨论

抗NMDA受体脑炎是最常见的自身免疫性脑炎，约占自身免疫性脑炎的80%，癫痫发作是脑炎最常见的症状之一，然而导致抗NMDA受体脑炎相关癫痫的机制目前尚不清楚，为进一步探讨，本研究制作了抗NMDA受体脑炎相关癫痫小鼠模型，基于该模型小鼠海马组织小胶质细胞极性的改变，为自身免疫性脑炎癫痫发作所致的炎症损伤提供理论依据。本研究结果提示，模型组小鼠EEG检测到异常放电，海马组织的神经元细胞受损，小胶质细胞和M1型小胶质细胞表达较对照组增加，炎症因子IL-1β和TNF-α也明显增多。

通常抗NMDA受体脑炎患者EEG都有异常放电，表现为弥漫性慢波、过度活动β波、极度δ刷和全面性节律活动δ波，EEG的正常与否不但影响着患者的预后，而且影响着癫痫的复发概率。本实验中模型组小鼠EEG检测到异常的神经元放电，表现为痫性波，这与临床研究相一致，81.2%的自身免疫性脑炎患者伴有癫痫发作的症状。同时本研究中抗NMDA受体脑炎相关癫痫小鼠海马组织CA1、CA2及DG区出现部分神经元细胞变性坏死，这可能是因为NMDA受体的活化介导兴奋性神经毒性，引起神经元损伤，损伤的神经元增加了神经元的兴奋性，诱发癫痫发作，所以小鼠出现咀嚼及点头等痫性症状，EEG存在痫性波。然而本实验中小鼠EEG没有表现出抗NMDA受体脑炎患者经典的δ刷波形，可能与患病病程有关。

IL-1β及TNF-α是中枢神经系统中最常见的炎症因子，有研究显示，癫痫发作可引起大脑中炎症因子IL-1β水平升高、海马中的TNF-α和IL-1βmRNA表达上调，本研究结果提示，小鼠海马组织中炎症因子IL-1β及TNF-α表达水平增高，说明脑部产生了具有炎症特性的分子免疫反应。神经元在受到损害、感染等刺激时通常可引起小胶质细胞的激活、增生，激活的小胶质细胞释放促炎细胞因子，增强炎性相关基因的表达。小胶质细胞活化后可以呈现两种激活状态：经典活化状态M1型和选择活化状态M2型。M1型小胶质细胞主要表达的是促炎型小胶质细胞，释放如IL-1β、TNF-α及NO等，表达标志物一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)；M2型小胶质细胞则表达抑炎性因子，包括IL-10、IL-13、转化生长因子-β、血管内皮生长因子、内皮生长因子及精氨酸1(Arginase 1，Arg-1)等，表达标志物Arg-1。本实验中模型组小鼠海马组织中蛋白IBA-1表达明显增加，神经元受到了刺激而引起小胶质细胞的活化。同时模型组小鼠海马组织中iNOS表达明显增高，M1型小胶质细胞大量激活，Arg-1蛋白表达与对照组比较没有明显变化，抑制炎症反应的M2型小胶质细胞没有明显激活或抑制。这说明该模型可能是以激活的经典活化状态M1型小胶质细胞为主，这与Davies等的研究一致。而激活的M1型小胶质细胞表现为促进炎症因子如IL-1β、TNF-α的释放。以上说明了抗NMDA受体脑炎相关癫痫发作同样有这样的表现，抗NMDA受体抗体和癫痫的发作刺激中枢神经系统，激活小胶质细胞，炎症反应激活，促进M1型小胶质细胞活化，促进炎症因子IL-1β及TNF-α的释放。

炎症反应有多种激活途径，p38丝裂素活化蛋白激酶(p38 mitogen activated，protein kinase，p38MAPK)是其中之一。p38MAPK是丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)家族成员之一，可以通过调节促炎性因子IL-1β及TNF-α等的分泌，影响神经炎症反应的发生发展。在其他各种疾病中发现激活p38 MAPK信号通路可以使IL-1β、TNF-α大量分泌。既往研究表明，参与小胶质细胞激活的信号通路有很多，p38就是其中之一，促进p38MAPK蛋白磷酸化可以激活M1型小胶质细胞，释放炎症因子。然而本实验中与之不同的是，模型组小鼠海马组织磷酸化p38减少，小胶质细胞和M1型小胶质细胞却仍然被激活，IL-1β、TNF-α分泌增多，推测抗NMDA受体脑炎相关癫痫模型中，磷酸化p38减少可能跟NMDA受体激活钙激活/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 Ⅱ (calcium-activated/calmodulindependent protein kinase Ⅱ，CamKⅡ) 和SynGAP-MUPP1 有关。

通过本次研究表明，抗NMDA受体脑炎相关癫痫小鼠海马组织中神经元受损伤，小胶质细胞活化，M1型小胶质细胞激活，释放炎症因子IL-1β及TNF-α。