黑木耳多糖的分离制备及单糖组成初探

◎ 阮明倩

（济宁市粮食和物资储备保障中心，山东 济宁 272000）

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氢氧化钠、盐酸、95%乙醇、无水乙醇、氯仿、正丁醇、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、95.5%浓硫酸、6%苯酚和葡萄糖标准品均为分析纯，购自杭州米克化工；唾液、人工胃液、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖和N-AC-D-氨基葡萄糖（纯度均≥99%），购自阿拉丁试剂；1%NaOH溶液、甲醇、三氟乙酸（Trifluoroacetic Acid，TFA）和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-pheny-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）均为分析纯，购自杭州米克化工。

1.2 仪器与设备

Anglent 1100高效液相色谱仪：安捷伦；HH-S数显恒温水浴锅：金坛市国旺实验仪器厂；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；AL04型电子天平：梅特勒-托利多有限公司；移液枪：Dragon；RE-52旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 黑木耳粗多糖（AA）的提取

本文选用碱提法提取黑木耳粗多糖。将黑木耳子实体研磨成粉，过60目筛，按原料∶溶液=1∶160（m/V）加入1%（m/V）氢氧化钠溶液，80 ℃水浴加热搅拌3 h，用适量HCl中和NaOH。将制备得到的液体样品于2 000 r·min-1离心25 min。取上清液，按原料∶配液=1∶（4V/V）取适量上清液和95%乙醇，混匀，于4 ℃放置6 h后，于8 000 r·min-1离心10 min，将产生的沉淀物在去离子水中充分溶解。

1.3.2 多糖除杂

用透析法除去包括低聚糖在内的小分子杂质。将粗多糖溶液装入透析袋（3 000 Da）中，放置在容器中加入去离子水透析48 h，每隔一段时间换一次废水，重复多次。

1.3.3 多糖除蛋白

Sevag法条件温和，可保证多糖性质基本稳定，因此本文参照姜红[1]的方法，选用Sevag法除去蛋白质。但此法效率较低，若想要完全除尽蛋白质至少要重复5次。

1.3.4 多糖得率的测定

（1）苯酚-硫酸法测定总糖含量[2]。①标准曲线绘制。将葡萄糖标准品置于105 ℃烘干至恒重，准确称取0.1 g于去离子水中溶解，至1 L的容量瓶中定容。分别取葡萄糖标准品0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL，加入去离子水补充至0.5 mL，以0.5 mL去离子水为空白对照。均加入6%苯酚0.5 mL和浓硫酸2.5 mL，静置10 min，置于30 ℃水浴20 min后于490 nm测定吸光度。②样品含量测定。吸取待测样0.1 mL，加去离子水1.9 mL、6%苯酚l mL，迅速加入浓硫酸5 mL，振荡摇匀，30 ℃水浴加热20 min。在490 nm处测定吸光度（OD490），以水为空白对照，做3组平行实验。

（2）DNS法测定还原糖含量[3]。①标准曲线绘制。将葡萄糖标准品于105 ℃烘干至恒重，准确称取0.1 g溶于去离子水，至100 mL的容量瓶中定容。分别取1 mg·mL-1葡萄糖标准溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL，加入去离子水补充至1 mL，以1 mL去离子水为空白对照。均加入DNS溶液0.75 mL，混匀，沸水浴加热5 min，冷却至室温后加入去离子水3.25 mL。于540 nm测定吸光度，用空白管调零，得标准曲线。②样品含量测定。吸取待测样1.0 mL，加去离子水1.0 mL，水杨酸1.5 mL，充分混合，沸水浴加热5 min后立刻用冷水冷却至室温，加入21.5 mL去离子水，于540 nm处测定吸光度（OD540）。以水为空白对照，做3组平行实验。

1.3.5 多糖纯度的鉴定

将多糖配制成0.5%的溶液，4 000 r·min-1离心10 min，选用高效液相色谱法对多糖纯度进行鉴定，色谱参数如下。

高效液相色谱仪：Anglent 1100；分析柱：79911GF-083型 PL aquagel-OH 30（300 mm×7.5 mm，8 μm），79911GF-084型PL aquagel-OH 40（300 mm×7.5 mm，8 μm），两柱串联；流动相：去离子水；流速：1 mL/min；进样量：20 μL；柱温：30 ℃；检测器：示差折光检测器；检测温度：35 ℃。

1.3.6 黑木耳多糖体外水解物制备

取1 g（100 mL）AA，加适量唾液使之充分反应，用 1 mol·L-1的盐酸调节至 pH 2.5，加入溶于 0.05 mol·L-1盐酸的10%人工胃液1 mL，37 ℃水浴加热20 min，期间持续搅拌模拟胃肠蠕动，取出样品，立即用氢氧化钠溶液中和，透析后于-20 ℃保存。

1.3.7 黑木耳多糖体外水解物的单糖组成

本文采用PMP柱前衍生化HPLC法测定体外水解物的单糖组成[4]。

（1）水解多糖AA。将黑木耳粗多糖AA冻干，取10 mg冻干样品放入安瓿瓶，加入2 mol·L-1TFA 2 mL，火焰枪封口，110 ℃水解2 h，室温下冷却，加入甲醇除去剩余的TFA，于200 μL去离子水中复溶。

（2）制备单糖标准品。分别取50 mg D-木糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、N-AC-D-氨基葡萄糖，溶解于50 mL去离子水中配制成单糖标准品溶液。将上述6种溶液分别吸取100 μL于5 mL离心管中混匀配制混合标准品溶液。

（3）衍生化。分别取100 μL单糖标准品、混合标准品、多糖水解液于3个5 mL离心管中，共同加入100 μL 0.3 mol·L-1氢氧化钠溶液和 100 μL 0.5 mol·L-1甲醇，漩涡振荡30 s，70 ℃水浴加热30 min后冷却至室温，加入 100 μL 0.3 mol·L-1氯化氢溶液、100 μL 去离子水和1.6 mL氯仿。将各试剂充分混匀后振荡30 s，静置5 min，将上层水相装入离心管中，重复萃取3次，过0.45 μm针筒式水系膜后待测。

（4）高效液相色谱条件。色谱柱：Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm），附紫外检测器；检测波长：254 nm；柱温：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流动相：A乙酸铵（20 mol·mL-1），B乙腈。

梯度洗脱程序：0～10 min，16%→17%乙腈；10～ 35 min，17% → 22% 乙 腈；35～ 36 min，22%→16%乙腈。

2 结果与分析

2.1 多糖得率

得到总糖含量标准曲线为y=0.007 6x+0.018 4（R2=0.990 1），还原糖含量标准曲线为y=0.717 1x-0.004 9（R2=0.998 2），计算得多糖得率为52.08%。

2.2 多糖纯度的鉴定

AA经高效液相色谱分析，得到单一峰，推测多糖为单一组分。

2.3 黑木耳多糖的单糖组成分析

2.3.1 单糖标准品标准曲线

以单糖标准品峰面积为纵坐标，单糖标准品质量（mg）为横坐标，绘制标准曲线，得到单糖的回归方程和相关系数。甘露糖：y=496.42x+20.639，R2=0.996 6；氨基葡萄糖：y=1 039.6x-11.626，R2=0.997 8；葡萄糖：y=752.33x-4.405，R2=0.999 0；半乳糖：y=254.33x+12.443，R2=0.996 1； 木 糖：y=401.39x+15.62，R2=0.993 2；阿拉伯糖：y=1 726.9x+20，R2=0.993 4。

2.3.2 体外水解物的单糖组成

高效液相色谱法测定黑木耳多糖体外水解物的单糖组成结果如图1所示。各组分保留时间分别为14.5 min、19.9 min、23.2 min、24.8 min、26.9 min 和28.7 min，根据各组分出峰时间确定单糖组分为甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖，且甘露糖含量最多。由峰面积及单糖标准品的标准曲线回归方程计算，得到各单糖组分摩尔比为1.00∶0.12∶0.53∶0.07∶0.29∶0.53（以甘露糖为基准）。

图1 黑木耳多糖体外水解物的高效液相色谱图

3 结论

本文对碱提得到的多糖溶液采取苯酚-硫酸法测定总糖浓度，DNS法测定还原糖浓度，计算出多糖得率为52.08%。选取有合适吸收峰的多糖溶液进行体外水解，利用高效液相色谱测定粗多糖AA的单糖组成为甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖，摩尔比为1.00∶0.12∶0.53∶0.07∶0.29∶0.53。

分离纯化出结构单一、作用机理明确的黑木耳多糖成分是深入研究及开发黑木耳多糖衍生商品的难点之一，关键是要找到一种高效理想的分离制备纯化方法，为全面认识多糖化学结构与生物活性的关系和活性机制打下基础[5]。本研究只取得了一些阶段性的成果，要想研究出对健康有益的、能带来较高经济效益的黑木耳多糖深加工衍生产品，需要广大学者的共同努力，取得更有价值的研究成果。