不同产地豆豉中纳豆菌株的筛选鉴定及耐受性的研究

刘紫嫣 孙于寒 彭浩 王梦姣

(陕西理工大学生物科学与工程学院,陕西 汉中 723000)

前言

纳豆自唐朝传入日本,是一种由豆类经过纳豆菌发酵而成的食品,其特点为本身带有一定的黏性和较臭的气味以及微甜的味道[1]。一般为偏中生、孢囊不膨大、具有鞭毛,对温度、pH值以及胆盐等有较高的耐受性[2]。纳豆激酶是由纳豆芽孢杆菌分泌产生的一种具有纤溶作用的丝氨酸蛋白酶[3],在保健产品开发上具有良好的应用前景。

本研究以我国云南、贵州、陕西和湖南等不同产地的豆豉为研究材料，对其中的纳豆菌株进行筛选鉴定，并探究了其对温度、pH的耐受性，结果获得4株高产纳豆激酶，且对温度和pH具有高耐受性的纳豆芽孢杆菌，以期为纳豆产品的开发提供借鉴。以期为解决上述问题提供优质菌株资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

云南豆豉，云南易门山里香食品有限责任公司；贵州豆豉，贵州华瑞名鼎食品有限公司；陕西豆豉，市售；湖南豆豉，湖南华越食品有限公司。

1.1.2 培养基与试剂

1.1.2.1 NBP培养基

蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、NaCl 5.0g、琼脂20.0g、去离子水1.0L。

1.1.2.2 脱脂奶培养基

10%脱脂奶、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl、2%琼脂，pH 7.2～7.4。

1.1.2.3 液体种子培养基

不添加琼脂的NBP培养基。

1.1.2.4 发酵培养基

胰蛋白胨20.0g、Na2HPO45.0g、NaH2PO41.5g、葡萄糖20.0g、CaCl20.2g、MgSO40.3g、去离子水1.0L。

1.2 方法

1.2.1 纳豆芽孢杆菌的分离纯化

将云南、贵州、陕西、湖南4地豆豉25.0g加入装有225mL的均质袋中(均质压力为200MPa)，均质好的菌悬液进行10-4、10-5、10-63个梯度稀释。用移液器取10-4、10-5、10-6进行梯度稀释液各200μL在NBP平板上，于37℃倒置培养48h[6]；采用连续划线的方法进行纯化，并将纯化后的菌株进行低温保藏[7]。

1.2.2 纳豆菌的筛选

制备(浓度)纳豆菌悬液，吸取20μL置于脱脂奶培养基平板，37℃培养48h。分别测定透明圈直径和菌落直径，计算R(透明圈直径/菌落直径),求出R平均值。每组处理均设置3个重复。选取R平均值较大的菌株进行下一步实验。

1.2.3 纳豆激酶活力测定

用Folin-酚法测定初筛到的10株菌株的酶活力，选取纳豆激酶活力最高的菌株作为复筛的目标菌株。

1.2.4 种子液的制备

挑取试管斜面纳豆菌至液体种子培养基(装液量为50/250mL)，并在37℃，180r·min-1摇床振荡培养48h[8]，备用。

1.2.5 粗酶液的制备

将纳豆菌液体种以2%的接种量接种于液体发酵培养基，并在37℃，180r·min-1的条件下培养48h。离心(10000r·min-1，30min)获得含有纳豆激酶的发酵上清液，备用。

1.2.6 纳豆激酶的活性测定

1.2.6.1 酪氨酸标准曲线的制作

取7支试管，在680nm的波长下分别测定各管的吸光度。以OD680值为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线[9]。见表1(1号试管为不含酪氨酸的空白对照)。

表1 酪氨酸标准曲线

1.2.6.2 纳豆激酶酚法酶活测定

将1%的酪蛋白溶液放入37%的水浴中预热5～10min；取3支试管编号为1、2、3(1为空白对照，2、3为平行样品)，在3支试管中加入1%的酪蛋白溶液1.0mL,于37%恒温水浴下预热5～10min。在试管1中加入10%三氯乙酸溶液4mL，在试管2、3中加入1%的待测酶液1.0mL。将试管1、2、3置于37℃的恒温水浴10～15min；向3支试管中加入10%三氯乙酸溶液4mL。静置，离心15min(4000r·min-1)。离心结束后取1.0mL的上清液于另外3支试管中，加入5.0mL的0.55mol·L-1Na2CO3溶液和福林酚试剂1.0mL,进行显色反应[10]；用酶标仪测定680nm样品吸光度。先用空白调零，再分别测定样品平行1、2、3的吸光度，取平均值为各样品的吸光度。

1.2.7 纳豆芽孢杆菌的鉴定

采用《伯杰细菌鉴定手册》[11]第8版对分离得到的菌株进行项生理生化鉴定实验。

1.2.8 纳豆激酶高产菌株的特性研究

1.2.8.1 对温度的耐受性

将菌株用基础种子培养基培养24h,取发酵液1mL,采用无菌操作,稀释到一定的倍数,分别置于温度92℃和96℃中水浴10min、15min和20min,流水冷却,以室温下未经水浴的菌株作为对照,采用平板计数法计算水浴后菌株的存活率,据此判断其对温度的耐受性[12]。

1.2.8.2 对pH值的耐受性

配制2种不同的pH缓冲液，取不同的量配成不同pH的溶液，其中,A液为0.1mol·L-1的柠檬酸溶液，B液为0.2mol·L-1的磷酸氢二钠。将菌株接种于基础种子培养基,在温度37℃,转速150r·min-1下振荡培养24h,使菌种的OD600值控制在1.5～1.6,并将此种子液保存备用[13]。将此种子液以一定量接种于具有不同pH值的基础种子培养基中,于温度37℃下培养45min,取培养液1mL,经适当稀释后,涂布平板计数,计算相对存活率,以此判断其对pH值的耐受性。

2 结果与讨论

2.1 纳豆芽孢杆菌的分离纯化结果

根据纳豆芽孢杆菌的特性，将4个产地的豆豉样品进行稀释涂布培养后，分离出了30株菌落形态不同的菌株。云南5株，编号为N1～N5；贵州10株，编号为G1～G10；陕西8株，编号为S1～S8；湖南7株，编号为H1～H7。菌落呈白色或微黄色，湿润、黏稠，不透明或微透明，表面褶皱，具有芽孢杆菌的形态特征。

2.2 产纳豆激酶菌株的筛选结果

在牛肉膏培养基进行画线培养，分离出单一的菌落,并在脱脂奶培养基平板上点样,结果见图1。测量透明圈直径和菌落直径,计算比值R(R=透明圈直径/菌落直径)。

从图1可知，N2、G1、S3、H3的R值最大，可初步判断其产酶能力最强。

图1 筛选结果

2.3 纳豆芽孢杆菌菌株复筛结果

2.3.1 酪氨酸标准曲线

按1.2.3的方法，测得波长680nm下各试管的吸光度，见表2。根据表2所得数据，绘制以吸光度为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标的标准曲线[14]，如图2。(根据回归方程计算吸光常数K，即吸光度为1时酪氨酸μg数)。根据图2可知，K=72.97。

表2 酪氨酸标准曲线

图2 酪氨酸标准曲线

2.3.2 纳豆激酶活力值

酶活力定义：在37℃，pH 7.4的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需酶量为一个酶活力单位。根据所述方法测得各菌株的吸光度，并代入公式计算各菌株的酶活力，结果见表3。

酶活力计算公式：

酶活力(U·mL-1)=[A/(T×W)]×K×V×N

式中，A为平均吸光度；T为反应时间10min；W为反应酶液体积1mL；K为吸光常数72.97；V为反应液总体积5mL；N为稀释倍数100。

表3 初筛菌株酶活力结果

根据目前国内报道的纳豆激酶活性大多为600～900U·mL-1[15],部分高产纳豆激酶酶活力为1137.15～1222.727U·mL-1[16-18]。此外，还有研究通过诱变得到的高产纳豆激酶菌株，酶活可达1846.15～2095.23U·mL-1[19]。由表3可知，从4个产地获得菌株中，N2、G1、S3、H3,酶活力分别为1926.41U·mL-1、1791.41U·mL-1、2079.65U·mL-1、1616.28U·mL-1，属于高产酶活的菌株。

2.4 纳豆芽孢杆菌的鉴定

将N2、G1、S3、H3以枯草芽孢杆菌为对照，各项具体指标结果见表4。

表4 纳豆芽孢杆菌的鉴定

由表4可知，筛选得到的N2、G1、S3、H3的理化性质为革兰氏反应、芽孢染色、葡萄糖实验、木糖实验、蔗糖实验、吲哚实验、甲基红实验、淀粉水解实验、明胶实验、酪氨酸实验、产过氧化氢酶实验、硝酸盐还原实验均与对照组枯草芽孢杆菌一致，由此可以判断这4株菌均为枯草芽孢杆菌。

2.5 纳豆激酶高产菌株的特性研究

2.5.1 对温度的耐受性

菌株在制粒的过程中会遇到瞬时高温,以及在运输储存的过程中会遇到高温的影响，所以菌株对温度的耐受性表现的越强,则菌种的活性越好,越不容易受到温度的影响而死亡。

本实验选用了92℃和96℃分别进行实验。N2、G1、S3、H3存活率与温度的关系见表5。

通过实验可知，N2、G1、S3、H3的存活率受温度的影响很大。条件为92℃和96℃水浴5min时，同一菌株的存活率相差较为明显，相差达39%左右；随着时间的增加，同一菌株的存活率差值逐渐降低，在10min时，同一菌株的存活率差值约为12%，不足15%。当时间在15min时，二者的存活率仅为4%左右。当时间在20min时，N2和S3还有0.11%、0.06%的存活率，剩下的G1和H3均被杀死。

因此,菌株N2和S3相对于G1和H3具有较强的温度耐受性。

表5 纳豆芽孢杆菌存活率与温度的关系

2.5.2 对pH的耐受性

纳豆芽孢杆菌作为菌剂在生产使用以及储存的过程中,经常会遇到不同的pH,因此有必要考虑pH对菌种的影响以及其适应性。结果见表6。

表6 纳豆芽孢杆菌存活率与pH的关系

由表6可知，N2、G1、S3、H3对不同pH值范围表现出较强的适应性。pH范围6.60～7.00的条件时，均达到85%以上，可见存活率都很高。pH为2.0～5.10的范围内，4种菌株的存活率均受pH的影响较大。而在pH为2.20、3.30以及9.50时存活率损失很大，达到50%。因此菌株在偏酸以及偏碱的条件下不利于生长。通过比较，N2和S3具有较强的pH耐受性。

3 讨论

本实验采用稀释涂布法从云南、贵州、陕西、湖南4个产地豆豉样品中分离筛选出30株目标菌株，由产蛋白酶的特性，并测定纳豆激酶活性，从4个地方各筛选出具有高产纳豆激酶的菌株[20]：N2、G1、S3、H3，酶活力分别为1926.41U·mL-1、1791.41U·mL-1、2079.65U·mL-1、1616.28U·mL-1。

通过对高产纳豆激酶菌株N2、G1、S3、H3进行了温度、pH的耐受性研究，得出如下结论:N2和S3相较G1和H3而言，对温度、pH的耐受性较强。在生产中若采用N2、S3菌种进行纳豆的生产，在确保质量的前提下，可减少纳豆的发酵时间，为企业以及厂家带来经济效益。N2、S3菌种对环境(温度和酸碱度)耐受更强，可在纳豆生产环境受不可控因素影响时，保证产品的质量，保护企业、厂家的经济效益。并且N2、S3菌种对菌株运输、储藏环境的要求相比其他菌株较低，同环境下更好地确保菌株存活率，节约了成本。该菌株对后续纳豆激酶的研究，起到了一定的作用，有望作为纳豆工艺生产的工业菌株，对于提高我国豆豉的质量、档次以及在国际市场中的地位都具有良好的实用价值。