阿托伐他汀激活AMPK通路抑制COPD小鼠膈肌内质网应激的作用机制

任慧敏， 韩树池， 杨 淼， 王 慧， 刘宏强

膈肌是呼吸运动主要的驱动力，在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)的发病过程中，长期气流受限会增加膈肌负荷，引起膈肌萎缩及收缩力下降。膈肌萎缩及收缩力下降会加重COPD患者的肺功能减退、严重者引起呼吸衰竭，影响疾病的长期预后[1-2]。相关研究认为，内质网应激(endoplasmic reticulum stress， ERS)介导的细胞凋亡是COPD发病过程中导致膈肌功能障碍的重要因素[3]。因此，研究膈肌ERS的调控机制有助于深入认识COPD发病机制、发现COPD新的治疗靶点。

阿托伐他汀是临床广泛使用的降脂药物，近年其抗炎和改善气道功能的作用受到关注。国内外临床研究和基础研究均证实阿托伐他汀对COPD的气道功能及炎症反应具有抑制作用[4-6]。另有动脉粥样硬化及脂肪肝相关的动物实验证实，阿托伐他汀通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase， AMPK)的方式减轻ERS[7-8]，但阿托伐他汀在COPD发病过程中调控ERS的作用机制尚不清楚。本文将以膈肌ERS为靶点，在野生型(wild type， WT)小鼠及AMPK基因敲除(knockout， KO)小鼠中研究阿托伐他汀激活AMPK通路抑制COPD小鼠膈肌ERS的作用机制。

1 材料与方法

1.1动物 WT C57BL/6J小鼠(上海西普尔-必凯实验动物公司)，生产许可SCXK(沪)2018-0006；AMPK KO小鼠(遗传背景C57BL/6J)购自北京唯德生物科技有限公司。

1.2试剂 玉溪香烟(红塔烟草基团)，焦油量10 mg、烟气烟碱量0.9 mg、一氧化碳量 10 mg、84 mm；阿托伐他汀钙片(辉瑞制药)；HE染色试剂盒(上海歌凡生物公司)，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天公司)，AMPK、p-AMPK、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、肌醇酶1α(IRE1α)、活化转录因子6(ATF6)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-12一抗(Abcam公司)，真核起始因子2α(eIF2α)及磷酸化真核起始因子2α(p-eIF2α)一抗(CST公司)。

1.3仪器 小动物肺功能仪(上海塔望智能科技公司)，显微镜(Nikon公司)，凝胶电泳及成像系统(上海天能公司)。

1.4方法

1.4.1 动物分组、造模及给药 WT C57BL/6J小鼠随机分为AMPK-WT组、AMPK-WT+COPD组和AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀组，AMPK KO小鼠随机分为AMPK-KO组、AMPK-KO+COPD组和AMPK-KO+COPD+阿托伐他汀组，每组各8只。采用香烟烟雾吸入法建立COPD模型：将小鼠放入40 cm×25 cm×20 cm的薰烟箱进行烟雾吸入，每日上午2次、下午2次，每次持续45 min、每次使用1支香烟，上午2次及下午2次的间隔为10 min，每周一至周五进行烟雾吸入，连续进行12周。阿托伐他汀干预参照何永鸿等[5]的研究进行，方法如下：造模第7周起，每天烟雾吸入前1 h给予阿托伐他汀10 mg/kg灌胃、1次/d，连续6周。

1.4.2 气道功能检测 腹腔注射1%戊巴比妥钠、剂量40 mg/kg，麻醉后进行气管插管，与小动物肺功能仪连接，测定0.3 s用力呼气容积(forced expiratory volume in 0.3 second， FEV0.3)占用力肺活量(forced vital capacity， FVC)的比值(FEV0.3/FVC)、呼气峰流速(peak expiratory flow， PEF)。

1.4.3 肺组织及膈肌病理改变的HE染色 完成气道功能检测后处死小鼠，解剖得到适量肺组织及膈肌组织，4%多聚甲醛固定后制作厚度4 μm的病理切片，采用HE染色试剂盒进行染色，按照试剂盒说明书进行操作，在显微镜下观察肺组织及膈肌组织病理改变。

1.4.4 膈肌组织细胞凋亡率的TUNEL检测 另取膈肌组织的病理切片，采用TUNEL试剂盒进行染色，按照试剂盒说明书进行操作，在显微镜下观察TUNEL阳性染色和DAPI阳性染色的细胞并计数，凋亡率=TUNEL阳性细胞数/DAPI阳性细胞数×100%。

1.4.5 膈肌组织中蛋白表达的Western blot检测 另取适量膈肌组织，加入RIPA裂解液并匀浆，提取得到蛋白后采用BCA法测定蛋白浓度，根据蛋白浓度取30 μg蛋白加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行Western blot实验，电泳后电转移至PVDF膜，孵育1∶1000稀释的p-AMPK、AMPK、PERK、IRE1α、ATF6、PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP、Caspase-12一抗或1∶3000稀释的β-actin一抗过夜，孵育1∶2000稀释的二抗1 h，在凝胶成像系统中显影并计算蛋白条带吸光度，以β-actin为内参，对p-AMPK、AMPK、PERK、IRE1α、ATF6、PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP、Caspase-12的表达水平进行半定量分析。

1.4.6 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行统计学处理，实验数据均为计量资料，经正态性检验符合正态分布，多组间比较采用方差分析、差异有统计学意义的资料进一步采用LSD-t检验进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1气道功能比较 与AMPK-WT组比较，AMPK-WT+COPD组小鼠的FEV0.3/FVC、PEF明显降低(P<0.05)；与AMPK-WT+COPD组比较，AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀组小鼠的FEV0.3/FVC、PEF明显增加(P<0.05)，AMPK-KO+COPD组小鼠的FEV0.3/FVC、PEF明显降低(P<0.05)；与AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀组比较，AMPK-KO+COPD+阿托伐他汀组小鼠的FEV0.3/FVC、PEF明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠气道功能的比较

2.2肺组织及膈肌病理改变

2.2.1 肺组织 AMPK-WT组和AMPK-KO组小鼠肺组织内支气管及肺泡结构规则；AMPK-WT+COPD组小鼠肺组织内肺泡结构紊乱、肺泡壁破裂、肺泡腔扩大；AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀组小鼠肺组织病理改变较AMPK-WT+COPD组减轻；AMPK-KO+COPD组小鼠肺组织病理改变较AMPK-WT+COPD组加重；AMPK-KO+COPD+阿托伐他汀组小鼠肺组织病理改变较AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀组加重。见图1。

2.2.2 膈肌 AMPK-WT组和AMPK-KO组小鼠膈肌内肌纤维排列规整；AMPK-WT+COPD组小鼠膈肌内肌纤维断裂、排列混乱；AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀组小鼠膈肌病理改变较AMPK-WT+COPD组减轻；AMPK-KO+COPD组小鼠膈肌病理改变较AMPK-WT+COPD组加重；AMPK-KO+COPD+阿托伐他汀组小鼠膈肌病理改变较AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀组加重。见图2。

2.3膈肌中p-AMPK表达 AMPK-WT+COPD组小鼠膈肌中p-AMPK表达较AMPK-WT组增加(P<0.05)；AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀组小鼠膈肌中p-AMPK表达较AMPK-WT+COPD组增加(P<0.05)。AMPK-KO组、AMPK-KO+COPD组和AMPK-KO+COPD+阿托伐他汀组小鼠膈肌中均不表达AMPK和p-AMPK。见图3。

2.4膈肌中细胞凋亡率 AMPK-WT+COPD组膈肌中细胞凋亡率较AMPK-WT组增加(P<0.05)；AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀组膈肌中细胞凋亡率较AMPK-WT+COPD组降低(P<0.05)；AMPK-KO+COPD组膈肌中细胞凋亡率较AMPK-WT+COPD组增加(P<0.05)；AMPK-KO+COPD+阿托伐他汀组膈肌中细胞凋亡率较AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀组增加(P<0.05)。见图4。

2.5膈肌中ERS通路比较 AMPK-WT+COPD组膈肌中PERK、IRE1α、ATF6表达较AMPK-WT组增加(P<0.05)；AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀组膈肌中PERK表达较AMPK-WT+COPD组降低(P<0.05)，IRE1α、ATF6表达与AMPK-WT+COPD组比较差异无统计学意义(P>0.05)；AMPK-KO+COPD组小鼠膈肌中PERK、IRE1α、ATF6表达较AMPK-WT+COPD组增加(P<0.05)；AMPK-KO+COPD+阿托伐他汀组膈肌中PERK、IRE1α、ATF6表达较AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀组增加(P<0.05)。见表2、图5。

表2 各组小鼠膈肌中PERK、IRE1α、ATF6表达比较

2.6膈肌中PERK下游基因表达 AMPK-WT+COPD组膈肌中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12表达较AMPK-WT组增加(P<0.05)；AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀组膈肌中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12表达较AMPK-WT+COPD组降低(P<0.05)；AMPK-KO+COPD组膈肌中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12表达较AMPK-WT+COPD组增加(P<0.05)；AMPK-KO+COPD+阿托伐他汀组膈肌中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12表达较AMPK-WT+COPD+阿托伐他汀组增加(P<0.05)。见图6、表3。

表3 各组小鼠膈肌中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12表达比较

3 讨论

近些年，临床常用的降脂药物阿托伐他汀在COPD治疗中的价值受到越来越多关注。有临床研究[4]报道阿托伐他汀改善COPD患者的气道功能，也有基础研究[5-6]证实阿托伐他汀改善COPD模型动物肺组织的ERS及炎症反应。本研究采用被动香烟烟雾吸入的方法建立COPD小鼠模型，造模后给予阿托伐他汀干预并发现气道功能指标FEV0.3/FVC、PEF增加，肺组织内肺泡结构紊乱、肺泡壁破裂、肺泡腔扩大及炎症细胞浸润等病理改变明显改善，与既往研究[5-6]报道一致。COPD病情的发展变化不仅涉及肺组织炎症反应激活等病理改变，还与膈肌萎缩及收缩力下降密切相关。长期气流受限、呼吸肌负荷增加是造成COPD患者膈肌功能障碍的重要因素，为了更加全面了解阿托伐他汀在COPD治疗中的价值，本研究以膈肌功能障碍为切入点，观察了其对COPD小鼠膈肌的影响及机制。

COPD发病过程中膈肌功能障碍的组织学特征为肌纤维断裂、生物学特征为膈肌细胞凋亡[9-10]。本研究在被动香烟烟雾吸入建立的COPD模型小鼠中观察到膈肌内肌纤维大量断裂、细胞凋亡率明显增加，与既往其他研究[9-10]关于COPD发病过程中膈肌组织学特征及生物学特征的报道一致。从造模第7周起给予阿托伐他汀灌胃干预、连续6周，经阿托伐他汀干预后，COPD小鼠膈肌中肌纤维断裂明显改善，细胞凋亡率明显降低，表明阿托伐他汀对COPD小鼠的膈肌功能障碍具有改善作用，这一现象是对既往阿托伐他汀改善COPD气道功能及肺组织病理改变等实验结果的补充，从改善膈肌功能障碍的角度揭示了阿托伐他汀治疗COPD的价值，进而有助于今后更加全面地认识阿托伐他汀在COPD治疗中的价值。在此基础上，本研究还深入探究了阿托伐他汀改善膈肌障碍的相关分子机制。

ERS是在吸烟、感染、缺氧等病理条件下调控细胞凋亡的重要生物学环节。内质网是负责蛋白质合成、加工、转运的细胞器，发生ERS时未折叠及错误折叠蛋白在内质网中聚集，进而通过下游PERK、IRE1α、ATF6三种膜蛋白进行信号转导引起未折叠蛋白反应，促进细胞凋亡的发生[11-13]。有研究报道，COPD患者膈肌中存在过度激活的ERS及未折叠蛋白反应[4]。本研究在COPD小鼠的膈肌中检测到ERS的三种信号蛋白PERK、IRE1α、ATF6均表达增加，与既往临床研究的结果吻合。阿托伐他汀抑制ERS的作用已经在动脉粥样硬化模型、脂肪肝模型中得到证实[7-8]，本研究在COPD小鼠接受阿托伐他汀干预后检测到膈肌中PERK的表达水平降低，IRE1α、ATF6的表达无明显变化，表明阿托伐他汀抑制COPD小鼠膈肌中PERK介导的ERS。

在PERK介导ERS激活的过程中，高表达的PERK能够引起eIF2α磷酸化，而后依次引起ATF4、CHOP表达增加，最终增加cleaved caspase-12表达增加并介导细胞凋亡[14-16]。为了进一步验证膈肌中PERK介导的ERS及细胞凋亡在COPD发病及阿托伐他汀发挥治疗价值中的作用，本研究对PERK下游的四种蛋白进行了检测。COPD模型小鼠膈肌中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12的表达水平均明显增加，与PERK表达及细胞凋亡率增加的结果一致。经阿托伐他汀干预后，COPD小鼠膈肌中p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-12的表达水平均明显降低，与阿托伐他汀抑制COPD小鼠膈肌中PERK表达及细胞凋亡的作用吻合。由此进一步确认阿托伐他汀对COPD小鼠膈肌中PERK介导ERS的抑制作用。

根据Xiong等[7]及Zhang等[8]的研究，阿托伐他汀抑制ERS的作用与激活AMPK通路有关。AMPK是具有广泛生物学作用的丝苏氨酸激酶，炎症、缺氧、吸烟等应激因素能够促进AMPK发生磷酸化并代偿性起到抗炎、抗ERS等作用[17-18]。已有研究[19-21]在COPD中证实肺组织中p-AMPK的表达增加，使用AMPK激动剂显著减轻COPD的肺组织病理改变。本研究在COPD模型小鼠的膈肌中检测到p-AMPK的表达水平增加，与既往其他学者关于COPD发病过程中AMPK通路激活、p-AMPK表达增加的研究结果[19-20]一致；同时本研究还在阿托伐他汀干预后观察到COPD小鼠膈肌中p-AMPK的表达水平进一步增加，提示阿托伐他汀在COPD中的治疗价值可能与激活AMPK通路有关。

为了深入认识AMPK通路在COPD膈肌功能障碍及阿托伐他汀减轻膈肌PERK介导ERS中的作用，本研究通过Cre-Loxp系统获得了AMPK基因敲除小鼠，采用被动香烟烟雾吸入法建立AMPK基因敲除的COPD小鼠模型，与野生型COPD小鼠比较，敲除AMPK后COPD模型小鼠的气道功能减退及肺组织病理改变均加重，表明AMPK在COPD发病过程中起到气道保护作用，与既往AMPK激动剂改善COPD病情的报道[21]一致。进一步观察膈肌情况发现，敲除AMPK后COPD模型小鼠膈肌内肌纤维断裂、细胞凋亡及PERK介导的ERS均明显加剧，表明AMPK在COPD的膈肌功能障碍中起保护作用。在AMPK基因敲除的COPD小鼠接受阿托伐他汀干预后，与阿托伐他汀在野生型COPD小鼠中改善膈肌内肌纤维断裂、细胞凋亡及PERK介导ERS的作用比较，敲除AMPK基因使阿托伐他汀的上述改善作用明显减弱，表明阿托伐他汀改善COPD小鼠膈肌功能障碍及膈肌中PERK介导ERS的作用与激活AMPK通路有关。

综上所述，本研究为深入认识AMPK通路在COPD发病中的作用及阿托伐他汀在COPD治疗中的作用提供了依据。首先，AMPK通路在COPD的发病中起保护作用，对气道功能、肺组织病理改变及膈肌功能障碍均有改善作用，敲除AMPK后COPD病情加重；第二，阿托伐他汀明显改善COPD小鼠的气道功能、肺组织病理改变和膈肌功能障碍，其中阿托伐他汀改善膈肌功能障碍是本项目的创新性发现之一；第三，阿托伐他汀改善膈肌功能障碍的作用与其通过激活AMPK通路减轻膈肌中PERK介导的ERS有关。