12份水稻恢复系的遗传多样性分析及指纹图谱构建

王衍坤, 韦新宇, 胡 杰, 夏法刚, 周元昌, 季彪俊

(1.福建农林大学农学院，福建 福州 350002；2.福建省三明市农业科学研究院,福建 沙县 365509)

水稻(Oryzasativa)是重要的粮食作物，养活了世界上一半以上的人口[1-2]。实现水稻“三系”(不育系、恢复系、保持系)配套[3]，利用杂种优势是提高水稻产量的重要育种途径[4]。恢复系是水稻“三系”育种重要的一环，了解恢复系间的遗传多样性有助于提高恢复系选育效率，也是进行精确杂交组配的重要保障。

SSR标记以PCR为基础，具有基因组分布广泛、引物设计简便、实验操作简单和成本低等优点，在遗传图谱构建[5]、关联分析[6]等研究中得到了广泛的应用。DNA指纹图谱技术可以鉴别材料之间的遗传差异，是鉴定水稻品种真实性和种子纯度的重要手段[7-8]。近年来，研究人员利用SSR技术对水稻亲本遗传多样性分析和品种指纹图谱构建开展了大量的研究工作。马红勃等[9]利用12个SSR标记对42份水稻材料进行了DNA指纹图谱构建，并通过遗传多样性分析将42份材料分成6个类群，很好地反映了它们之间的亲缘关系。马菊等[10]通过53对SSR标记将7组水稻衍生品种及其亲本准确地分类。张弩等[11]利用10对SSR标记构建了宜昌地区49份杂交籼稻品种的指纹图谱，为宜昌地区水稻品种保护和种子鉴定提供了依据。陈越等[12]利用22对SSR分子标记构建了中国南方地区100份水稻资源的SSR指纹图谱身份证，发现南方地区不同省份水稻资源间的遗传差异较大。以上研究主要涉及水稻品种和三系不育系的遗传多样性及指纹图谱分析，但对恢复系的研究不多。

本研究以福建省三明市农业科学研究院水稻研究所自主选育的8份恢复系(‘明恢’系列)和中国南方应用较广的4份恢复系为研究对象，用40对SSR标记进行遗传多样性分析和指纹图谱构建，明确它们之间的遗传亲缘关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取的12份恢复系由福建省三明市农业科学研究院水稻研究所提供。其中，8份为三明市农业科学研究院选育的‘明恢’系列恢复系，另外4份是水稻生产中广泛种植的恢复系(表1)。2018年5月，于三明市农业科学研究院水稻研究所水稻育秧田，取各供试材料新鲜幼嫩的叶片，放于锡箔纸中置-80 ℃冰箱备用。

表1 参试恢复系及其系谱Table 1 Test materials and their pedigrees

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 采用SDS小量提取法[10]进行全基因组的DNA提取，并用1.0%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

1.2.2 PCR扩增及产物检测 PCR总反应体系为20 μL,体系包括10×PCR Buffer 2 μL，Taq酶0.5 μL，dNTP混合物1.5 μL，模板DNA 2 μL，引物(10 μmol·L-1) 2 μL，无菌水12 μL。PCR反应程序为：①95 ℃，预变性5 min；②95 ℃，高温变性30 s；③55 ℃，低温退火50 s；④72 ℃，延伸1 min；⑤重复第2～第4步骤，35次；⑥72 ℃，延伸8 min，使产物延伸完整；⑦4 ℃，保存。PCR产物在6.0%(W/V)非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳90～100 min，使含有多态的条带分离，再用银染法显色。显色后的胶置于医用X光玻璃上观察扩增结果[6]。选用40对在水稻基因组均匀分布的多态性SSR标记。

1.2.3 标记数据分析及聚类分析 PCR标记数据读取方法参照马红勃等[9]方法，通过NTSYS 2.1软件计算所得数据的遗传相似系数，并以该结果进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 SSR分子标记多态性分析

选用40对SSR标记，对参试恢复系的DNA进行多态性扫描。按照有带记为“1”、无带记为“0”的读带原则进行标记数据的读取(图1)，共产生75个位点。每对SSR引物产生的条带数目在1～4条之间，平均每对引物产生条带数目为1.875条。

1.明恢82;2.明恢86;3.明恢118;4.明恢611;5.明恢826;6.明恢1259;7.明恢2155;8.明恢3009;9.华占;10.闽恢3301;11.R498;12.R527。

2.2 指纹图谱的构建

利用11个多态性好的标记建立参试恢复系的DNA指纹图谱(表2)。由表2可见，表中每列数据是某一SSR标记在12份材料中检测出的带型的数字化代号，1个代号代表1个等位基因。每一行中的数字按从左到右的顺序构成一条字符串，共可建立12条字符串。当12条字符串相互之间没有重复时，表明这11份SSR标记能将12份恢复系全部区分开，即每条字符串能唯一标识1个恢复系，如明恢82的分子身份证号码是：01100110010。因此，可以将每一条字符串形象地称为每份恢复系的分子身份证号码。对于已存入DNA指纹库中的每一个品种来说，其分子身份证号码是唯一的。

表2 参试水稻恢复系的DNA指纹图谱Table 2 DNA fingerprint map of 12 rice restorer lines

2.3 聚类分析

根据40 对SSR引物所检测出的75个位点，用NTSYS 2.1软件计算参试材料的遗传距离矩阵(表3)，并绘制亲缘关系树状图(图2)。12份恢复系之间的遗传距离在0.07～0.89之间(表3)，说明参试材料之间具有较好的遗传多样性。从图2可见，遗传相似系数的变异范围为0.62～0.93，在0.74处可以将这12份材料分为6个类群。第Ⅰ类群包括明恢82、明恢86、明恢118、明恢2155、闽恢3301、R527，共6份材料；第Ⅱ类群包括明恢826和R498；其他4份材料(明恢3009、明恢1259、华占和明恢611)各为一个类群。

表3 参试水稻恢复系的SSR标记遗传距离Table 3 Genetic distance of 12 rice restorer lines based on SSR markers

在遗传相似系数0.79处可以将第Ⅰ类群的6份材料分成3个亚类：明恢82为第①亚类，明恢86和明恢118为第②亚类，明恢2155、闽恢3301和R527为第③亚类。经过系谱确认(表1)，闽恢3301的父本是R527，因此二者具有非常小的遗传距离(0.07)，遗传相似系数达到0.93。以上表明, 本试验所用SSR分子标记聚类结果能较好地反映供试材料的亲缘关系，能从分子遗传层面为材料组配提供较好的遗传信息。

3 讨论

3.1 SSR标记有助于分析水稻材料的遗传多样性

SSR标记目前已广泛地应用于水稻育种和遗传分析中[10]。本研究利用40对SSR标记检测12份水稻恢复系，共检测出75个多态性位点，每对SSR标记检出1～4个多态性位点，平均每对引物检出1.875个多态性位点，相对较少，可能是由于试验所用材料数量较少所致。本试验构建的指纹图谱能很好地将12份恢复系分开，并通过遗传聚类图明确标出它们之间亲缘关系的远近，为后续遗传组合的组配提供了分子水平的依据。

3.2 SSR标记可以明确水稻的亲缘关系

利用SSR标记分析恢复系间遗传多样性，并结合系谱(表1)分析可以明确材料间亲缘关系。比如，明恢86、明恢118和明恢2155的亲本材料中都有明恢63，因此从系谱来看，三者之间具有很高的亲缘关系。利用40对SSR标记构建的遗传聚类图(图2)，将明恢86、明恢118和明恢2155聚类到同一大类，表明三者遗传相似度很高，与系谱记载结果吻合。系谱记载明恢611亲本跟其他供试‘明恢’系列材料无共同亲本(表1)，遗传聚类图将其单独聚类成一组，其遗传距离与其他供试材料较远。这都说明SSR标记可以在分子层面验证恢复系的系谱关系，可进一步指导基于亲缘关系的恢复系选育。

闽恢3301是福建省农业科学院生物技术研究所自主选育的强恢复系，在生产上应用广泛[13]，组配出很多优异的超级杂交稻品种，比如与优质不育系天丰A配组育成的天优3301，示范推广面积广、增产显著[14]。吴明基等[15]报道，系谱记载闽恢3301为明恢86与绵恢436的杂交后代，但田间观察显示闽恢3301一些性状与R527较为类似，而与明恢86相似的特征较少。闽恢3301并不是系谱记载的明恢86与绵恢436的杂交后代，而是来源于绵恢436与R527的杂交后代。本研究表明，闽恢3301与R527的遗传距离更近，与明恢86距离较远，这与吴明基等[15]研究结果相一致。这说明利用SSR标记分析遗传多样性可以明确材料之间的亲缘关系，消除因记载失误等原因造成的材料系谱错误，降低杂交组合选配的错误率。

3.3 DNA指纹图谱可用于检验水稻品种真实性和种子纯度

SSR标记目前广泛应用于产量性状[16]、品质性状[17]、抗性[18]等控制位点的分子标记定位以及突变体[19]基因的挖掘。以SSR标记为基础的水稻DNA指纹图谱，可以为水稻品种真实性和纯度的鉴定提供可靠的技术保障。本研究中，40对SSR标记在参试材料中都具有多态性且全基因组分布，为水稻分子遗传图谱构建提供了新的标记选择。周佩雯等[20]利用SSR标记进行了4份节水抗旱稻材料的DNA指纹检测，并判定其中一个为旱优73的“近似品种”。这说明SSR标记在水稻品种真实性鉴定中可以发挥重要作用，有利于提高市场监管效率，净化种子市场。本研究用40对SSR标记分析了12份供试恢复系的遗传多样性，并用11对核心标记构建了供试材料的指纹图谱，可为相关材料的真实性鉴定提供依据。