基于iTRAQ多重标记串联质谱技术系统性筛选乳腺癌患者血清蛋白表达的差异分析

刘艳翠　　张欣　　李文媛　　孙成　　孙平　　赵微

[摘要] 目的 观察串联质谱技术在乳腺癌血清蛋白表达中的差异。方法  选取2020年2月～2021年2月黑龙江省牡丹江医学院附属二院收治的乳腺癌新辅助化疗患者20例作为研究组，包含10例化疗有效患者及10例化疗无效患者，同时选取8名健康者作为对照组。采集所有患者的肘静脉血，分别采用高通量miRNA、iTRAQ表达谱测序技术，从“组学”的角度对乳腺癌新辅助化疗不同疗效患者miRNA差异表达谱、外周血单个核细胞蛋白组进行研究。随后，先进行Pathway通路分析，该过程在蛋白质层面进行，然后找出sRNA的成熟体序列，在此过程中严格根据miRbase18数据库。将已知的cDNA序列整理为一行，对得到的sRNA对应靶基因进行预测，Pathway分析靶基因，最后将同一Pathway通路中的sRNA靶基因及蛋白质寻找出来。结果  研究組和对照组共筛选出19个差异表达蛋白，选取其中具有较大表达差异的肝细胞生长因子（HGF）进行验证。iTRAQ标记图谱显示，研究组和对照组的血清HGF表达水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）。研究组Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者的血清HGF表达水平逐渐升高（P<0.05），均高于对照组（均P<0.05），符合iTRAQ标记图谱鉴定结果。结论  串联质谱技术用于筛选发现乳腺癌细胞HGF表达水平升高具有显著效果，可有效指导临床诊治乳腺癌的工作，将有效参考提供给靶向治疗药物的开发。

[关键词] iTRAQ多重标记串联质谱技术;系统性筛选;乳腺癌;血清蛋白表达

[中图分类号] R737.9          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）16-0033-03

Analysis on serum protein expression differences in breast cancer patients systematically screened by iTRAQ-based tandem mass spectrometry

LIU Yancui1 ZHANG Xin2  LI Wenyuan1 SUN Cheng1 SUN Ping1 ZHAO Wei1

1.Teaching and Research Room of Anatomy， Mudanjiang Medical University of Heilongjiang Province， Mudanjiang 157011， China; 2.Department of Ultrasound， the Second Affiliated Hospital of Mudanjiang Medical University of Heilongjiang Province， Mudanjiang 157011， China

[Abstract] Objective  To analyze the effectiveness of isobaric tags for relative and absolute quantitation （iTRAQ）-based tandem mass spectrometry for systematic screening of serum protein expression differences in breast cancer patients. Methods A total of 20 patients with neoadjuvant chemotherapy for breast cancer were selected as the study group， which contained 10 patients with effective chemotherapy and 10 patients with ineffective chemotherapy， and 8 healthy subjects were selected as the control group at the same time. Elbow venous blood was collected from all patients， and high-throughput sequencing in micro-ribonucleic acid （miRNA） expression profiling and iTRAQ technique were used to study the differential miRNA expression profiles and peripheral blood mononuclear cell proteome of patients with different efficacy of neoadjuvant chemotherapy for breast cancer from the perspective of “omics”. Subsequently， the Pathway analysis was performed at the protein level， and then the mature sequences of small RNA （sRNA） were identified， in which the miRbase18 database was strictly followed. The known complementary deoxyribonucleic acid （cDNA） sequences were organized into one line， the target genes corresponding to the obtained sRNA were predicted and analyzed by the Pathway analysis， and finally the sRNA target genes and proteins in the same Pathway were screened out， and the correlation between differential proteins and miRNA target genes was analyzed. Results A total of 19 differentially expressed proteins in the study and control groups were screened out， and hepatocyte growth factor （HGF） with great expression differences was selected for validation. iTRAQ labeling-based profiles showed that there was a statistically significant difference between study group and the control group in serum HGF expression levels （P<0.05）. The Western Blot validated and proved that serum HGF expression levels in patients of stage Ⅰ， stage Ⅱ and stage Ⅲ in the study group were progressively increased （P<0.05）， and were higher than those in the control group （all P<0.05）， which was consistent with the results of iTRAQ labeling-based profile identification. Conclusion iTRAQ-based tandem mass spectrometry for systematic screening of serum protein expression differences in breast cancer patients reveals elevated HGF expression levels in breast cancer cells， which will effectively guide the clinical diagnosis and treatment of breast cancer and provide an effective reference to the development of targeted therapeutic drugs.

[Key words] iTRAQ-based tandem mass spectrometry; Systematic screening; Breast cancer; Serum protein expression

尽管乳腺癌新辅助化疗的蛋白质组学研究已在组织和血清水平发现一系列差异表达蛋白，且miRNA表达谱测序技术的应用使得乳腺癌相关miRNA取得一定的成绩，但这些研究仅涉及乳腺癌表达蛋白检测和miRNA差异表达谱，即差异表达蛋白和miRNA差异表达的研究是割裂的[1]。目前，尚未见到二者之间相关联的研究。这也为后续的研究提供了契机。本研究统计分析2020年2月～2021年2月黑龙江省牡丹江医学院附属二院乳腺癌新辅助化疗患者20例的临床资料，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般資料

回顾性选取2020年2月～2021年2月黑龙江省牡丹江医学院附属二院乳腺癌新辅助化疗患者20例作为研究组，包含10例化疗有效患者及10例化疗无效患者，同时选取8名健康者作为对照组。研究组患者年龄29～57岁，平均（38.26±6.45）岁;TNM分期：Ⅰ期7例（35.00%），Ⅱ期10例（50.00%），Ⅲ期3例（15.00%）。对照组8名健康者均为女性，年龄30～58岁，平均（39.14±6.86）岁。两组研究对象的一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 基于iTRAQ技术研究乳腺癌患者外周血单个核细胞蛋白表达谱  督促患者空腹至少8 h，采集肘静脉血6 ml，放置在10 ml EDTA-2K抗凝管中。分离外周血单个核细胞，此过程严格依据Feicoll分离液说明书。提取蛋白质并定量，采用SDS电泳、蛋白质酵解、iTRAQ标记、SCX分离、基于Triple TOF 5600分析LC-ESI-MS/MS、Western blot对实验进行验证。最后，采用Mascot蛋白质鉴定软件，运用IPI_human v3.87数据库（91464 sequences）检索和鉴定蛋白[2]。

1.2.2 高通量测序技术研究乳腺癌新辅助化疗患者外周血单个核细胞miRNA表达谱  分离外周血单个核细胞，此过程严格依据Feicoll分离液说明书。提取总RNA，对RNA浓度进行检测，利用Solexa技术测序进行Small RNA文库构建和测序，分析两组样本miRNA差异。验证Stem-loop qRT-PCR对部分差异表达miRNA，分析Small RNA数据处理和信息。

1.2.3 乳腺癌新辅助化疗患者外周血单个核细胞蛋白质组与miRNA关联分析  将候选miRNA和蛋白选取出来，分别运用The miRanda、TargetScan和PicTar三大miRNA靶基因预测数据库找到差异表达miRNA共有的靶基因，预测miRNA靶基因，最后进行生物信息学分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 iTRAQ标记图谱鉴定结果

iTRAQ标记图谱显示，两组研究对象的血清HGF表达水平差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.2 Western Blot 验证差异蛋白

研究组Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者的血清HGF表达水平逐渐升高（P<0.05），均高于对照组（均P<0.05），符合iTRAQ标记图谱鉴定结果。见表1。

3 讨论

新辅助化疗（NAC）在早期乳腺癌的治疗中能够促进肿瘤的缩小、手术切除机会的提升，同时能够对体内疗效进行直接评估，因此通常在对化疗敏感性的影响因素进行探究的过程中应用[3～5]。如果患者经新辅助化疗将病理学结果完全缓解，其预后更好[6，7]。在蛋白质组学中，定量蛋白质组学占有重要地位[8，9]。基于iTRAQ技术的蛋白质组学研究是近年来发展起来的新技术，可在宏观的角度上系统地从复杂的蛋白质组中探测数千种蛋白质，高通量、高灵敏度、高准确性研究疾病发展机制和治疗机制[10]。iTRAQ技术包括肽反应、报告、平衡3个部分[11]。其中，肽反应部分能够对上肽段进行标记，原因为共价连接肽N端与氨基酸侧链，该部分能对几乎所有的蛋白质进行标记[12];报告部分可有8种，因此iTRAQ试剂能够对8组样品进行标记[13]。iTRAQ在标记完蛋白质后通过平衡部分保证其标记的肽段质核比相同，最终得知样本蛋白质的定量信息[14]。

既往研究结果表明，乳腺癌与特定蛋白质和miRNA具有密切关系，但同时也表明这些研究均以某一蛋白质或某一miRNA作为出发点进行研究，尚未将蛋白质和miRNA作为宏观整体进行分析[15，16]。新辅助化疗治疗乳腺癌具有极为复杂的影响机制[17，18]。因此，miRNA与蛋白质的研究应综合起来，才能系统地对乳腺癌新辅助化疗疗效机制有一个整体的认识，同时也有助于治疗靶点的筛选[19，20]。本研究结果表明，研究组和对照组共筛选出差异表达蛋白19个，选取其中具有较大的表达差异的肝细胞生长因子（HGF）进行验证。iTRAQ标记图谱显示，两组血清HGF表达水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）。研究组Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者的血清HGF表达水平逐渐升高（P<0.05），均高于对照组（均P<0.05），符合iTRAQ标记图谱鉴定结果，说明iTRAQ技术能够帮助临床充分了解疾病的病理机制，从而有效防控和诊治疾病。

综上所述，串联质谱技术对发现乳腺癌细胞HGF表达水平升高具有较高的临床价值，可对临床诊治乳腺癌工作起到有效指导，且给靶向治疗药物的开发提供有效参考。

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（收稿日期：2021-07-06）