不同检测方法在结核性脑膜炎诊断中的应用价值分析

张丽，周忠，陈默，陈秋悦，万雅璐，王倩

（贵州省贵阳市公共卫生救治中心 呼吸与危重症学科，贵州 贵阳 550002）

0 引言

结核性脑膜炎是结核分枝杆菌感染所引发的脊膜、脑膜的非化脓性炎症性疾病，是肺外结核的一种，多数患者均有急性、亚急性、慢性血行播散型肺结核，其残疾率与死亡率均较高[1-2]。结核性脑膜炎，其起病隐匿，具有进展速度慢特点，部分患者的疾病起病急骤，在疾病的早期，疾病症状较为轻微，但是患者颅内压水平的升高，可出现颅内压增高、脑膜刺激征等的表现[3]，如视乳头水肿、呕吐、头痛等，病情严重者会出现去皮质状态、脑强直发作等的情况[4]，对患者的生命安全，造成威胁，因此，积极做好患者疾病的诊断以及治疗干预，对其预后改善意义重大。本研究主要对不同的检测技术，在诊断结核性脑膜炎中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

取结核性脑膜炎患者，为其实施细菌学检测技术（脑脊液抗酸杆菌涂片、脑脊液分枝杆菌慢速培养）、分子生物学检测方法[脑脊液结核/非结核分枝杆菌核酸的检测（即PCR检测法），脑脊液结核分枝杆菌的检测，利福平耐药基因检测（Gene Xpert检测）]、免疫学检测方法[PPD试验（结核菌素试验）、外周血T-SPOT·TB（外周血T细胞斑点试验）]、脑脊液常规、生化实验室检测结果等检测，例数276例，时间为2020年1月-2021年12月，对其检测的结果进行分析。纳入标准：确诊存在结核性脑膜炎；局部神经损害症状者。排除标准：其他感染所致中枢神经系统疾病者；伴有腰穿禁忌证者；近期（3个月）抗结核治疗者。276例患者中，年龄16～66岁，平均（40.36±11.27）岁；病程1～39d，平均（16.98±7.22）d。

1.2 方法

1.2.1 PPD检测

左前臂掌侧1/3处，将0.1mL卡介菌纯白蛋白衍生物稀释剂注入，48～72h后，检查注射部位，测量浸润硬结的相关垂直径，并测量横径，若均值≥5mm，即代表为阳性，若在<5mm，则为阴性。

1.2.2 T-SPOT·TB检测

肝素抗凝管，外周静脉血采集，5～10mL，密度梯度离心法作外周血单个核细胞的分离，已包被抗体微量板四孔中，将滤液培养蛋白10、早期分泌性靶抗原6、阳性对照植物血凝素、阴性对照细菌培养液等加入，每孔中，将外周血单个核细胞加入后，于37℃的培养中，进行培育，培训时间为16～20h。采用磷酸盐缓冲液，实施5次的洗涤免疫，200倍稀释浓度标记抗体试剂，在每个反应孔中，均加入辣根过氧化物酶标记的相关链霉菌卵白素，在37℃的温度下，进行1h孵育，磷酸盐缓冲液5次洗涤，每个反应孔中加入50ulACE底物显色溶液，室温中孵育7min。去离子水洗涤培养板，终止反应。室温干燥培养板每个反应孔中，深蓝色清晰斑点的数目，进行记录。阴性对照孔斑点数≤5个，检测孔A、B斑点数≥6个，为阳性；阴性对照孔斑点数≥6个，检测孔A、B斑点数≥阴性对照孔2倍斑点数，为阳性；反之为阴性。

1.2.3 培养慢速培养脑脊液分枝杆菌

腰穿后取1～2mL脑脊液实施结核菌的培养，以全自动分枝杆菌培养鉴定/药敏仪实施结核菌的培养，并实施药敏试验，按照操作说明，对脑脊液培养，8周后若无菌生长，则表示为阴性。

1.2.4 脑脊液结核/非结核分枝杆菌核酸检测

多采用检测试剂盒，即样品DNA提取试剂，PCR反应试剂、特异性扩增引物，所述特异性扩增引物有16SrRNA扩增引物MTC与Rv0355扩增引物CD192组成，分析结核与肺结核分枝杆菌种属特异性基因，优化引物选择设计，并优化检测条件，提供更准确、更加灵敏、更加快捷的结果。可通过扩增产物是否生成来判断目标基因是否存在。

1.2.5 Gene Xpert检测（脑脊液结核分枝杆菌及利福平耐药基因检测）

以IS6110和gyrB为靶基因，针对靶基因的六个特定区域设计F3，B3，FIP，BIP四条特异性引物。终产物为具有不同茎长度茎环结构的DNA和带有许多环折叠结构的DNA混合物，可通过扩增产物是否生成来判断目标基因是否存在。

1.3 观察指标

对结核性脑膜炎患者经PPD检测、脑脊液结核分枝杆菌培养、外周血T-SPOT·TB检测、脑脊液结核/非结核分枝杆菌核酸检测、脑脊液结核分枝杆菌检测及利福平耐药基因检测等多种方法疾病检出情况分析。

1.4 数据分析

SPSS 22.0软件实施数据处理，方差同质性检验方法，定性数据以“χ²”核实，采用（%）表达。P<0.05，显著差异。

2 结果

多种方法联合检测，相较于单一方法检测，其对结核性脑膜炎的检出率，更高（P<0.05），如表1。

表1 不同方法对结核性脑膜炎疾病检出情况分析[n(%)]

3 讨论

结核性脑膜炎是结核分枝杆菌，侵入至其蛛网膜下腔，所致蛛网膜、软脑膜累及脑血管部分、脑实质病变的疾病，是神经系统的结核疾病。结核性脑膜炎发生后，有着较高的残疾率以及死亡率，因此，及时为结核性脑膜炎患者实施诊断，并采取治疗干预，对患者病情的改善有重大意义。结核性脑膜炎的症状与其他中枢神经系统感染较相似，误诊率较高，临床常选择脑脊液结核杆菌培养、脑脊液涂片镜检等方法，实施疾病的诊断，虽然有着一定的价值，但是阳性检出率较低，且易发生假阳性[5-7]，因此，应选择更加合理的方法，进行疾病的检测。

本研究中，多种方法联合检测，相较于单一方法检测，其对结核性脑膜炎的检出率更高，P<0.05。即代表多种方法联合检测，于结核性脑膜炎诊断中，有着较高的价值。PPD在结核性脑膜炎诊断中应用，虽然可获得一定的效果，但是其单独应用，较易出现假阳性的情况。结核病原学是对结核性脑膜炎诊断的金标准，但是较易受到标本中细菌数量的相关影响，且培养结核分枝杆菌的周期较长，其检测的阳性率较低，对于疾病早期快速诊断，存在一定的局限性。随着PCR技术水平的不断进步，使得脑脊液结核/非结核分枝杆菌核酸检测的应用价值得以提高，灵敏度较高，研究显示，检测脑脊液结核/非结核分枝杆菌核酸，诊断结核性脑膜炎，其敏感度的差异性可能与实验室PCR所用的引物、靶基因、反应条件不同等有关，但是其特异度较高，相较于结核病原学，其有着较高的灵敏度以及特异度，因此，脑脊液结核/非结核分枝杆菌核酸检测在结核性脑膜炎诊断中有着一定的价值[8-9]。利福平耐药基因检测是美国公司研发的半巢式的一种实时荧光定量PCR体外诊断方法，其是以利福平耐药基因rpoB基因作为靶向基因，在2h内同时进行结核分枝杆菌以及对利福平是否耐药的检测，此种方法被WHO推荐用于诊断肺外结核中。利福平耐药基因检测在结核性脑膜炎诊断中应用，有着较高的时效性，且能够对患者的病情、预后以及生存情况进行一定的判断，对患者疾病的诊治有着一定的指导意义[10-11]。ESAT-6/CFP-10融合蛋白，是结核分枝杆菌复合群基因RD-1区域，结核特异性蛋白抗原，经在少数致病性的分枝杆菌的基因组中存在，也可在结核分枝杆菌复合群中存在，可刺激细胞，使其产生INF-γ，在结核性疾病诊断中，受到卡介苗等因素的影响较小，因此两种抗原多肽结合制备，可提高检测的特异性，且能够提高检测的敏感性[12-13]，此种方法多数应用于2周以上原因不明发热者结核病筛查中，或者存在HIV感染、免疫力低下等肺外结核病等患者的相关诊断中疾病诊断中，卡介苗接种人群对于结核病的筛查，此技术操作简单，且具有快捷的优点，能够避免患者出现免疫功能损伤，所致假阳性的情况。根据以上原理，外周血T-SPOT·TB检测可对结核抗原特异性T淋巴细胞检测，可采取酶联免疫吸附法及酶联免疫斑点法，在特异性抗原刺激下，生成特异性INF-γ[14]。外周血T-SPOT·TB检测具有简单快捷的特点，可防止免疫功能受损所致假阳性的情况，更好提高疾病的检出率[15]。虽然外周血T-SPOT·TB检测有着一定的应用价值，但是单一方法进行疾病的诊断，易出现误诊与漏诊的情况，临床常将多种检测方法相结合，以此促进疾病检出率的提高。

综上所述，不同方法在结核性脑膜炎患者疾病诊断中应用，均有着一定的价值，多种方法联合检测，可更好为患者疾病的诊治提供参考依据，意义重大。