NASH患者外周血乏氧诱导因子1a-反义RNA 1和自噬基因Beclin1变化及其临床意义*

张 羿，尹 刚，赵艳萍

非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)中一种病理学严重的疾病，其发病率逐年升高，已成为肝炎的第二大病因[1]。目前，NASH的发病机制尚未完全阐明，用于临床评估的实验室指标也十分有限[2]。自噬是实现细胞自身代谢需求和某些细胞器更新的重要过程，而当机体面临缺氧、饥饿、脂质沉积等应激状态时，会打破自噬平衡[3，4]。研究报道，自噬与脂质代谢存在关联，可能参与NAFLD的发生发展[5]。存在于乏氧诱导因子1a反义链1(hypoxia-inducible factor 1a-antisense RNA 1，HIF1a-AS1)上的长链非编码RNA(long chain noncoding RNA，LncRNA)可调控自噬必需蛋白Beclin1表达，参与自噬体的形成和成熟[6]。本研究检测了NASH患者外周血HIF1a-AS1和Beclin1水平，以分析其临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2019年1月～2021年4月在我院就诊的NASH患者118例，男80例，女38例；年龄为32～60岁，平均年龄为(45.3±7.5)岁；体质指数(BMI)为24.0～38.5 kg/m2，平均为(28.2±1.4)kg/m2。符合《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》[7]的诊断标准，其中合并有高血压[8]、糖尿病[9]或/和高脂血症[10]的NASH患者共49例。排除标准：病毒性肝炎、药物性肝损伤、肝豆状核变性等遗传性代谢性疾病等其他原因引起的肝炎；伴有严重的感染性疾病或血液系统疾病；既往有肝移植史；合并恶性肿瘤；处于妊娠、哺乳期女性；既往有精神疾病史。另选择同期在我院体检健康者118例作为对照组，男78例，女40例；年龄为33～59岁，平均年龄为(44.8±8.3)岁。两组性别和年龄比较，差异无统计学意义(P﹥0.05)，具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会审核通过，入组对象签署知情同意书。

1.2 肝活检 常规进行肝活检，NASH的诊断依据同时存在肝脂肪变、小叶内炎症和气球样变。根据肝纤维化程度的不同，分为早期NASH(F0/F1期纤维化)、进展期纤维化(F2/F3期)和NASH肝硬化(F4期)[7，11]。

1.3 血清检测 使用日本日立7600型全自动生化分析仪及其配套试剂检测空腹血糖(fasting plasma glucose，FBG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterin，LDL-C)水平；采用实时荧光定量PCR法检测外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)HIF1a-AS1水平(日本TaKaRa)；采用ELISA法检测血清Beclin1水平(武汉优尔生科技股份有限公司)。

2 结果

2.1 两组有关指标水平的比较 NASH患者FBG、血清TC、TG、LDL-C、Beclin1水平和PBMC HIF1a-AS1水平显著高于健康者，而血清HDL-C水平显著低于健康者(P<0.05，表1)。

表1 两组有关指标的比较

2.2 不同严重程度的NASH患者有关指标水平的比较 肝硬化和进展期纤维化性NASH患者FBG、血清TC、TG、LDL-C、Beclin1和PBMC HIF1a-AS1水平显著高于早期患者，血清HDL-C水平显著低于早期患者(P<0.05，表2)，而肝硬化患者一些指标也显著高于进展期纤维化患者(P<0.05，表2)。

表2 不同严重程度NASH患者有关指标的比较

2.3 有与无合并症NASH患者外周血指标水平的比较 有合并症的NASH患者FBG、血清TC、TG、LDL-C、Beclin1和PBMC HIF1a-AS1水平显著高于无合并症者，而血清HDL-C水平显著低于无合并症者(P<0.05，表3)。

表3 有与无合并症NASH患者外周血指标的比较

3 讨论

NAFLD包括单纯性脂肪性肝病、NASH及脂肪性肝纤维化和肝硬化，其中NASH是最具肝脏病变进展风险的阶段，严重影响患者身体健康和生活质量。及时、准确评估病情对于改善治疗结局和预后有关键作用。NASH典型的病理学表现为肝实质细胞呈弥漫性脂肪蓄积、变性、坏死及炎性细胞浸润。因此，血脂是NASH患者重要的观测指标[11]。临床研究[12]显示，多数NASH患者存在不同程度的肥胖，提示NASH的发生容易引起机体糖脂代谢异常。本研究结果显示，NASH患者FBG和血脂指标均显著高于健康者，究其原因可能是患者肝细胞出现脂肪变性后，脂质代谢能力降低，TC、TG和LDL-C大量蓄积，这种脂质代谢紊乱还会引起糖代谢异常，导致血糖升高，长期反复形成肝实质损伤[13]。据报道，NASH患者会表现出胰岛素抵抗，将进一步抑制TC和TG等的水解，同时促进外周脂肪组织分解成脂肪酸，大量的游离脂肪酸将通过门脉系统进入肝脏，导致TC和TG不断沉积[14]。

自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，自噬在机体的生理和病理过程中均能见到，与糖尿病、癌症等多种疾病密切相关。脂代谢紊乱是造成肝脏内脂质沉积的最根本的原因。当肝细胞内发生脂质沉积时，会损伤细胞功能，自噬可清除受损的细胞器，维持细胞内稳态，但过度自噬将加重细胞损伤，故自噬功能紊乱可能也参与了NAFLD进展[15]。研究[16]表明，高脂饮食会引起自噬，表现出双相变化，短期高脂饮食会降低自噬水平，随着高脂饮食的时间积累，自噬水平将增加，提示自噬对脂质合成和分解过程的影响呈动态分化。研究[17]还发现，自噬在维持体内葡萄糖平衡过程中也有重要作用，并受到胰岛素的调节。在正常情况下，机体不需要通过自噬获取能量，故胰岛素会抑制自噬水平。当人体处于饥饿状态下，胰岛素水平降低，会激活自噬，而当机体发生胰岛素抵抗时，胰岛素功能受损，自噬水平将增高[18，19]。因此，检测自噬相关基因表达，进一步为临床诊治提供参考依据。

LncRNA是一类重要的非编码RNA，可调控细胞生长、凋亡、自噬等多种生理过程。HIF1a-AS1位于人14号染色体HIF1a反义链上，对自噬环节具有调控作用[20]。基础研究[21]表明，HIF1a-AS1可能通过促进自噬相关基因beclin1表达，参与激活缺氧诱导的胰腺癌PANC1细胞自噬，从而调控胰腺癌的发病。Beclin1是参与哺乳动物自噬的特异性基因，主要通过Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶形成复合物，从而调节自噬活性。本研究结果发现，NASH患者PBMC HIF1a-AS1和血清Beclin1水平显著高于健康人群，提示当NASH发生时，体内自噬功能表现出明显的紊乱。同时，本研究通过比较不同病情和有无合并症的NASH患者糖脂代谢指标、HIF1a-AS1和beclin1水平，发现肝硬化患者FBG、TC、LDL-C和HIF1a-AS1水平显著高于纤维化和早期患者，HDL-C水平显著低于纤维化和早期患者，而肝硬化和纤维化患者TG水平显著高于早期患者，肝硬化患者beclin1水平显著高于早期患者，说明病情严重的NASH患者及合并有高血压、糖尿病或/和高脂血症等合并症的NASH患者体内糖脂代谢和自噬异常更为显著，分析原因可能是随着患者病情的加重，脂质沉积加剧，进一步加重糖脂代谢异常，长期脂质沉积作用将增加自噬水平，并介导凋亡的发生[22-24]。因此，PBMC HIF1a-AS1和血清beclin1可作为评估NASH患者病情的生物标志物。