顺铂诱导急性肾损伤关键基因的筛选和调控网络的构建

杨玲云 徐锦雯 刘洵薇 成芸 周红霞 赵丽萍

无锡市儿童医院肾脏风湿免疫科，无锡 214000

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是指在多种因素诱导下短期内出现肾功能减退的综合征，部分还可转变为慢性肾损伤甚至进展为终末期肾病，影响患者生命质量，并给家庭带来沉重的负担［1-2］。急性肾损伤病因多样，如缺血再灌注损伤、败血症、药物肾毒性等，而顺铂是导致化疗患者急性肾损伤最常见的原因。顺铂是最有效的化疗药之一，可用于膀胱癌、头颈部肿瘤、小细胞肺癌等恶性肿瘤的治疗。但顺铂在肾脏的蓄积导致肾小管的炎症、坏死，引起急性肾损伤限制其应用［3］。顺铂诱导急性肾损伤（cisplatin-induced AKI，CI-AKI）的机制尚不十分明确，暂无有效药物防治。

本研究挖掘了CI-AKI 过程的关键基因和信号通路，以期为肾脏保护提供新思路。我们在基因表达综合数据库（gene expression omnibus，GEO）中下载了CI-AKI 小鼠模型的测序数据，使用生物信息学分析筛选CI-AKI 组和正常组中的差异基因。采用基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组大百科全书数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）进行相关通路的富集分析，蛋白质互作网络（protein–protein interaction，PPI）及cytoscape 软件鉴定关键基因，并构建了转录因子（transcription factor，TF）/微小RNA（microRNA，miRNA）/信使RNA（mRNA）调控网络。

资料与方法

1、资料来源

数据提取时间：建库至2021年3月1日。我们从GEO（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）分别下载GSE106993 和GSE153625 数据。两组数据平台均为GPL21103，Illumina HiSeq 4000（小家鼠）。GSE106993 含有CI-AKI 组小鼠4 只，对照组小鼠4 只。GSE153625 含有CI-AKI 组小鼠4 只，对照组小鼠8 只。两组小鼠均为19～21 周C57BL/6 小鼠，测序组织为肾脏。

2、差异基因的筛选

采用Sangerbox（soft.sangerbox.com）软件对数据进行分析，其中R软件分析部分选用的是limma包（v 3.32.7）［4］。纳入标准是logFC≥1、FDR≤0.05。

3、GO及KEGG富集分析

通过DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）网站对差异基因进行GO及KEGG分析。

4、关键基因的筛选及鉴定

通过STRING数据库（https：//string-db.org/）构建差异基因的互作网络图，并使用Cytoscape 软件以互动得分0.4 为阈值对互作网络进行分析。然后使用cytohubba 插件鉴定关键基因。选取点度中心、接近中心、中介中心3 种算法排名前十的基因区交集。

5、构建TF/miRNA/mRNA 调控网络

通过TransmiRv2.0数据库（http：//www.cuilab.cn/transmir）对转录因子调控的miRNAs 进行预测，并与差异miRNAs 取交集，得到候选miRNAs［5］。通过miRWalk2.0在线软件（http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/）对候选miRNAs 进行靶基因（mRNA）的预测（miRWalk、miRanda、RNA22 和Targetscan 4 个软件预测得到共同靶基因），并与差异mRNAs 取交集（mNRA 与miRNA表达呈负相关）［6］。

6、靶向关键基因的中草药的预测

通过ETMC 数据库（http：//www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）筛选靶向关键基因的中草药，并取交集（同时靶向≥4个关键基因）［7］。

结果

1、CI-AKI小鼠模型中差异基因的分析

比较CI-AKI 组和对照组小鼠模型中基因的表达，在GSE106993 中得到1 387 个上调基因和1 182 个下调基因（图1A）。在GSE153625 中得到1 751 个上调基因和1 442 个下调基因（图1B）。通过取交集，得到CI-AKI 组中上调基因817个，下调基因769个（图1C、D）。

图1 顺铂诱导急性肾损伤组与对照组的差异基因。A：GSE106993 中差异基因的火山图；B：GSE153625 中差异基因的火山图；C：GSE106993和GSE153625中共同上调的基因；D：GSE106993和GSE153625中共同下调的基因

2、CI-AKI小鼠模型中差异基因富集分析

图2、图3 GO 及KEGG 富集分析结果显示，上调基因的生物过程主要涉及炎症和凋亡，下调基因的生物过程包括氧化还原和代谢，其中氧化还原是最重要的生物学过程，并包含最多的差异基因（图2A）；细胞外泌体、细胞质、黏着斑等细胞组成被上调基因所富集，而线粒体、线粒体内膜及基质被下调基因所富集，其中细胞外泌体是最主要的细胞组成（图2B）；上调基因的分子功能主要是蛋白的结合，包括蛋白酶、钙黏蛋白、层黏蛋白的结合，而氧化还原酶的活化、催化酶的活化以及同向转运体的活化被下调基因所富集，并且氧化还原酶的活化富集到最多的差异基因，提示氧化还原酶的活化是最重要的分子功能（图2C）；KEGG 分析结果显示代谢信号通路是最重要的通路，主要被下调基因所富集，而上调基因富集得到肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、P53信号通路。

图2 差异基因的基因本体论（GO）和京都基因与基因组大百科全书数据库（KEGG）通路分析。A：差异基因生物过程富集分析；B：差异基因细胞组成富集分析；C：差异基因分子功能富集分析；D：差异基因KEGG通路分析

图3 上调基因和下调基因的基因本体论（GO）和京都基因与基因组大百科全书数据库（KEGG）分析。A：上调基因；B：下调基因

3、CI-AKI过程中关键分子的鉴定

为了进一步挖掘差异基因中的关键分子，使用STRING网站构建差异基因的蛋白互作网络图，并运用Cytoscape 中cytohubba插件进行分析。选取点度中心、接近中心、中介中心3 种算法排名前十的基因取交集，得到8 个共同基因，其中上调基因：肿瘤蛋白P53（tumor protein P53，Trp53）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、信号传导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，Stat3）、Jun、胱 冬酶3（caspase 3 apoptosis related cysteine protease，Casp3）、钙黏蛋白1（cadherin 1，Cdh1）、前列腺素内过氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，Ptgs2），下调基因：过氧化氢酶（catalase，CAT），具体见表1。并构建了8个关键基因的相互作用网络（图4A）。

表1 8个关键基因3种中心度算法的值

4、TF/miRNA/mRNA 网络的构建

通过对GSE106993 中基因的重新注释，发现CI-AKI 组中差异表达的27 个miRNAs（图4B）。同时，使用TransmiR v2.0 鉴定8 个关键基因中的转录因子，得到2 个转录因子（Stat3、Jun）及其可能调控的miRNAs，并与差异miRNAs 取交集。最后，通过miRWalk2.0 对候选miRNAs 的靶基因进行预测并与差异mRNAs 取交集，得到4 个miRNAs 及其靶基因214个（图4C）。

5、靶向关键基因的中草药筛选

搜索ETMC 数据库，发现5 个关键基因（Trp53、Casp3、Ptgs2、EGF、Jun）可成为中草药治疗的靶点。通过对5 个关键基因的候选中草药取交集，最终得到2 种可能用于治疗CI-AKI的中草药（桑叶、半夏）（图4D）。

图4 基因互作网络。A：8个关键基因的蛋白互作网络；B：转录因子（TF）/微小RNA（miRNA）/信使RNA（mRNA）调控网络；C：差异表达miRNA；D：中药与靶基因的调控网络

讨论

顺铂具有穿透力强、疗效好、作用谱广、能与多种药物协同作用等优点，作为一线药物可用于多种癌症的治疗，但其肾毒性以及CI-AKI 严重限制了顺铂在临床中的应用。明确其发生发展机制，找寻有效的药物防治该病尤为重要［8］。

本研究基于GSE106993 和GSE153625 两个数据集，得到共同差异基因1 586 个，其中上调基因817 个、下调基因769 个。GO 富集分析显示上调基因主要与炎症和凋亡相关，而氧化还原过程及相关分子功能被下调基因所富集。KEGG 富集分析显示，肿瘤坏死因子通路、P53 信号通路相关基因在CI-AKI 过程中上调，而代谢通路相关基因则下调。

炎症反应是一个复杂的生物学过程，贯穿急性肾损伤的各个阶段［9］。坏死细胞释放胞内信号物质诱导促炎因子和趋化因子的释放，招募各种炎性细胞浸润，导致更多细胞死亡，形成细胞死亡-炎症的恶性循环［10］。TNF-α激活核因子-κB 的转录，促进炎症相关基因的转录表达［11］。TNF-α不仅能诱导炎症反应，还能激活死亡受体通路，促进细胞凋亡［12］。有研究表明，P53 信号通路参与了TNF-α 诱导的凋亡过程［13］。P53 可通过改变线粒体膜的通透性激活线粒体凋亡途径，诱导细胞凋亡［14］。在下调基因中富集到多个线粒体相关生物学过程、细胞成分及分子功能，这些提示CI-AKI 过程中存在线粒体功能障碍。线粒体功能障碍导致氧自由基生成增加，加重线粒体功能障碍，同时伴有大量细胞因子的释放，诱导炎症反应［15］。因此，炎症反应、细胞凋亡、线粒体功能障碍三者交互作用导致CI-AKI 的发生与发展。

通过构建PPI 网络，我们得到8 个关键基因（上调：Trp53、EGF、Stat3、Jun、Casp3、Cdh1、Ptgs2，下调：CAT）。小鼠基因与人类基因有个高度的同源性。已有研究表明，我们筛选到关键基因的人类同源基因在人体CI-AKI 过程中发挥重要作用。研究发现P53 在CI-AKI 早期表达上调，抑制P53 能改善CI-AKI［16］。P53 以 多种形成参与到CI-AKI过程，一方面调控细胞的多种死亡方式如：凋亡、坏死、铁死亡等，另一方面影响细胞的自噬过程［14，17-18］。STAT3是重要的炎症调控基因，它可以调节炎症介质的释放参与炎症反应，同时还能通过线粒体途径诱导细胞的凋亡［19-20］。抑制STAT3 的表达能显著改善顺铂诱导的急性损伤后的细胞凋亡和炎症反应［21］。c-Jun 是核转录激活蛋白1 重要组成部分，能够调节死亡以及炎症相关基因的表达［22］。c-Jun在多种肾脏疾病被激活，抑制c-Jun 的活化能改善肾脏炎症反应［23］。Casp3是细胞凋亡的最终执行者，受到多条凋亡通路的调控如TNF 通路，P53 通路［12，14］。CDH1 是钙黏蛋白家族的一员，其编码的E-钙黏蛋白更是上皮间质转化的重要标志。研究表明E-钙黏蛋白在急性肾损伤的小管细胞细胞中低表达，上调E-钙黏蛋白能缓解CI-AKI过程中的炎症反应和细胞凋亡［24］。EGF 是一种具有多种功能的细胞因子，在缺血再灌注损伤的小管细胞中低表达，而外源性的EGF有助于肾功能的恢复［25-26］。PTGS2 是炎症过程中的重要介质，通过调控前列腺E2 合成，促进白介素6 的表达，介导多种炎症反应［27］。选择性PTGS2抑制剂能减轻肾小球和肾小管的损伤，缓解急性肾损伤的进展［28］。CAT 是抗氧化系统中的重要一员，它能将过氧化氢分解成水和二氧化碳。CAT在CI-AKI模型中低表达，上调CAT能保护肾功能［29］。

miRNA 是一类在转录后调节基因表达的非编码RNA（19-25 核苷酸长度），它参与急性肾损伤的多个生物学过程。研究发现miR-449 在CI-AKI 中高表达，异常表达miR-449 通过去乙酰化酶1/P53/Bcl2 关联X 蛋白通路调节肾小管上皮细胞凋亡［30］。而人工合成的miR-500a-3p脂质体载体能显著改善肾损伤［31］。miRNA的表达受多种方式调节，其中转录因子是最常见的一种。P53 诱导的miR-199a-3p 降低雷帕霉素的表达和磷酸化，促进肾小管上皮细胞的肾损伤和细胞凋亡［32］。我们通过分析得到了多个差异表达的miRNA，并构建了TF/miRNA/mRNA 的调控网络，揭示CI-AKI过程中的潜在调控网络。

中药治疗急性肾损伤已有一些研究，知柏地黄丸能通过抑制Casp3的活化，减轻庆大霉素诱导的小管上皮细胞的凋亡［33］。白藜芦醇是一种天然酚化合物，它可通过活化去乙酰化酶1，去乙酰化P53，减轻顺铂诱导的小管上皮细胞的凋亡。我们通过靶向关键基因，筛选到了两味中药：桑叶和半夏。桑叶提取物桑叶黄酮能缓解高尿酸诱导的急性肾损伤［34］。桑叶提取物桑叶生物碱能减少氧自由基的产生，减轻氧化应激诱导的急性肾损伤［35］。半夏白术天麻汤通过上调铜锌超氧化物歧化酶和CAT2的表达，调控高血压性肾损伤中的氧化应激反应［36］。

本研究旨在为CI-AKI 的研究提供新思路，通过分析CI-AKI 小鼠模型中的差异基因，我们得到8 个关键基因和3 条重要通路，并构建了TF/miRNA/mRNA 调控网络，揭示关键转录因子潜在的调控机制。最后通过靶向关键基因，筛选到了两味中药，为CI-AKI的治疗提供参考药物。