miR-132对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤的保护作用

廖旺 杨少青 刘重旭 罗皓雨 侯涛 路关超

1广州医科大学附属第二医院神经内科，广州 510260；2陕西省富平县医院神经内科，渭南 711700

卒中是老年人致死、致残的最主要原因之一［1］。缺血性中风更为常见，占所有中风的87%［2］。缺血性中风通常是由血块阻塞脑部动脉引起的。组织血纤维蛋白溶酶原激活剂（tPA）是一种可分解血栓的溶栓药，是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的唯一治疗缺血性中风的药物［3］。但是，中风患者必须在中风症状发作后4.5 h 内接受此治疗。在此治疗时间范围之外使用tPA 进行治疗可导致出血性转化，可能对脑造成额外损害［4］。如果患者未在时间窗内到医院就诊，血凝块无法清除则可能导致残疾等卒中后遗症［5］。目前认为，脑缺血后细胞死亡的病理生理机制是由于血流中断，营养物质供应不足，从而触发细胞凋亡、炎症、兴奋性中毒、氧化应激和线粒体功能障碍过程，导致神经元死亡，其中谷氨酸兴奋性毒性是其重要特征。当神经细胞损伤，谷氨酸被大量释放到神经突触间隙，从而导致谷氨酸受体过度激活，进而使钙离子不断向神经元内流，最终引起DNA 损伤以及细胞凋亡等病理过程［6］。近期研究表明，脑缺血发生后，微小RNA（miR）表达谱可发生不同程度改变，这些miR 与炎症、自噬、凋亡和氧化应激均密切相关［7-8］。然而，miR-132 对谷氨酸诱导的神经元损伤是否具有保护作用尚不清楚［9］。2021 年9 月至2022 年3 月，笔者使用PC12 细胞建立了谷氨酸细胞损伤模型，以研究miR-132 对缺血性卒中的保护作用。

材料与方法

1、细胞与试剂

本实验所使用的PC12 细胞购于中国科学院上海细胞库。Lipofectamine 3000 购于美国Invitrogen 公司，实时聚合酶链式反应（real-time PCR）试剂盒购于日本TaKaRa 公司，TRIzol 试剂来于美国Thermo Fisher Scientific 公司，RIPA 细胞裂解液、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）检测试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司，CCK8试剂盒购于南京凯基生物技术有限公司，青霉素、链霉素购于Gibco BRL公司，荧光素酶检测试剂购自Promega 北京生物技术有限公司。流式细胞仪购自美国BD公司。miR-132 mimic（5'-ACCGUGGCUUUCGAUUGUUACU-3'），miR-negative control（NC） of the mimic（5'-CAGGUAAUCAACGCGGAGGUCA-3'）。

2、RNA表达检测

收集细胞，采用TRIzol法提取RNA，逆转录成cDNA，使用实时荧光定量PCR 法检测RNA 表达情况。本研究使用的引物序列：hsa-miR-132-3p forward，5'-TGCGCTAACAGTCTACAGCCA-3'及5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGG ATACGACCGACCATG-3'；U6-F为5'-GGTCACAGTGAACCGGTC-3'，U6-R为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

反应参数：90～95 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃30 s，PCR 进行30 个循环，72 ℃延伸10 min，反应体系为20 μl，以U6 为内参，所得数据采用2-ΔΔCt法进行表达量相对定量分析。

3、细胞活力检测

采用CCK-8 法测定细胞活力。取对数生长期的PC12 细胞，加入DMEM 培养基，接种于96 孔板中（密度为1×105/ml），移 除细胞培养基，使用PBS 洗2 次，分别采用瞬时转染法将miR-132 mimics（浓度分别为200、100、50 nmol/L）及NC mimics（浓度分别为200、100、50 nmol/L）转染入PC12 细胞，转染8 h 后去除转染液，加入1 ml OPTI-MEM 培养基继续培养24 h 及48 h。在荧光显微镜下观察示，转染效率达90%以上，表明转染条件可靠。加入10%CCK8。37 ℃孵育1 h，酶标仪测定光密度值（试验波长为570 nm，参比波长为450 nm）。细胞相对增殖率（%）=［（B-A）/B×100%］，A 为miR-132 mimics或NCmimics转染组OD值，B 为对照组OD 值。每个实验重复3 次，每次测量3次。

4、炎症因子检测

采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测炎症因子白细胞介素（IL）-1β、IL-6表达。按上述miR-132 mimics瞬时转染步骤进行瞬时转染，使miR-132 mimics终浓度为200 nmol/L，另设NC mimics 组（终浓度为100 nmol/L）、对照组，胰酶消化各组细胞后加入细胞裂解液（RIPA）50 μl 裂解细胞提取总蛋白，采用Bradford 方法进行蛋白定量。采用SDS-PAGE电泳分离总蛋白，每道孔上样50 μg 总蛋白质，电泳2 h 后，采用湿法转膜至PVDF 膜，将膜用5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃孵育一抗（1∶1 000 稀释）过夜，次晨采用TBST 漂洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶3 000稀释），37 ℃孵育1 h，ECL 显影，保存图像，以β-actin 为对照，采用Quantity One测光密度值。实验重复3次。

5、统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件。符合正态分布的计量资料数据以（）表示，多组间比较采用LSD-t 检验，计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1、谷氨酸处理后PC12细胞miR-132表达变化

使用谷氨酸处理后PC12 细胞后，谷氨酸组相对于对照组表达明显下调（P<0.05），表达空载体NC mimics 之后，miR-132 无明显改变，转染miR-132 mimics 后，miR-132 表达相对于对照组明显上调（P<0.05）。见图1。

图1 使用谷氨酸处理后PC12 细胞后miR-132 的相对表达量

2、谷氨酸对PC12细胞活力的影响

CCK8检测结果显示，与0mM组相比，PC12细胞存活率随着谷氨酸浓度（0、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mM）增高而降低，呈一定的浓度依赖性。当谷氨酸浓度为2.00 mM 时，PC12 细胞存活率为（48.02±5.24）%，显著低于0 mM 组（P<0.01）。因此，选择浓度为2.00 mM 的谷氨酸处理进行后续实验。见图2。

图2 使用谷氨酸处理后PC12细胞后细胞活力变化

3、转染miR-132后PC12细胞活力比较

CCK8 结果显示，与对照组相比，谷氨酸组细胞存活率明显降低（P<0.05），而谷氨酸+miR-132 组细胞存活率较谷氨酸组明显升高（P<0.01），表明miR-132 可明显改善谷氨酸损伤的PC12细胞活性。见图3。

图3 使用谷氨酸处理后PC12细胞后，过表达miR-132后细胞活力变化

4、转染miR-132后PC12细胞氧化应激水平比较

为进一步检测miR-132 对PC12 细胞的保护作用，我们检测了ROS 及MDA 水平。结果显示，与对照组相比，谷氨酸组ROS 水平明显升高（P<0.01），而谷氨酸+miR-132 组较谷氨酸组明显降低（P<0.01），表明miR-132 可明显改善谷氨酸引起的PC12细胞氧化应激损伤。见图4。

图4 使用谷氨酸处理后PC12细胞后ROS（A）及MDA（B）的变化

5、转染miR-132后PC12细胞炎症因子水平比较

为进一步检测miR-132 对PC12 细胞的保护作用，我们检测了炎症因子IL-1β 及IL-6 的水平。结果显示，与对照组相比，谷氨酸组IL-1β 平明显升高（P<0.001），而谷氨酸+miR-132 组炎症因子表达较谷氨酸组明显降低（P<0.01），同时，谷氨酸组IL-6 水平明显升高（P<0.001），而谷氨酸+miR-132 组炎症因子表达较谷氨酸组明显降低（P<0.001），表明miR-132 可明显改善谷氨酸引起的PC12 细胞的炎性反应。见图5。

图5 使用谷氨酸处理后PC12细胞后IL-6（A）、IL-1β（B）水平的变化

讨论

miR 是长20～24 个核苷酸的小非蛋白质编码RNA，可通过碱基配对识别信使RNA（mRNA）的3'非翻译区（3'-UTR），影响mRNA 稳定性或干扰蛋白质翻译，从而调节下游靶向基因的表达，影响许多生理和病理过程［10］。此外，miR 分泌到体液中，或可作为新型诊断、预后和治疗生物标志物［11］。目前，血液中的miR 在脑卒中及神经细胞保护等方面的作用仍有待研究。

越来越多的证据表明，例如卒中后的细胞增殖、造血、代谢及免疫功能。最新研究显示，卒中后患者miR 表达异常，miR 是缺血性卒中的病因和病理方面的关键介体。循环中的miR 不仅可监测治疗过程中的反应，同时可帮助判断预后。研究证据表明，卒中患者与健康者相比，循环中各种miR 的水平可能有所不同。最近，有研究表明卒中患者循环中的miR-335 相对于正常人下调。研究指出miR-335 的表达与血浆CaM 呈负相关，而细胞内钙的增加与中风的进展有关［12］。

已有研究表明，miR-132 与细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程密切相关。同时也有研究表明，miR-132 在卒中患者中表达上调，但miR-132 是否对卒中后的细胞损伤具有作用未有定论。先前的研究表明，转染miR-132 模拟物增加MAP2 标记的树突突起、Tau 标记的轴突突起和NF200 标记的神经纤维的长度［9］。这些结果表明，miR-132 的上调促进了神经可塑性。为进一步研究miR-132 的神经保护作用，本研究表明，经谷氨酸处理后的PC12 细胞的miR-132 表达明显上调，与此前的报道一致，提示miR-132可能对卒中后的细胞损伤具有重要作用。进一步的数据显示，谷氨酸可使细胞活力下降，而转染miR-132后，PC12细胞的活力得到明显改善。

为研究miR-132 在卒中后细胞损伤的作用机制，我们检测了谷氨酸处理后的炎症因子，结果表明，转染miR-132 后的PC12 细胞，神经炎症因子较谷氨酸组明显下调，提示miR-132 可能是通过改善神经炎症保护卒中后的细胞损伤。

氧化应激在卒中后的神经损伤中具有重要作用［13］。因此，我们检测了谷氨酸处理后的氧化应激水平，结果提示，谷氨酸诱导的氧化应激可被miR-132 减轻。由此提示，miR-132 对卒中后细胞损伤的作用可能与改善氧化应激相关。

综上所述，谷氨酸处理后的miR-132表达量明显降低，同时miR-132 可改善PC12 细胞谷氨酸诱导的氧化应激损伤及神经炎症，从而起到保护PC12神经细胞的作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突