烤烟醇化过程中的代谢物和脂质分析

黄桂红，谢华利，彭黔荣，彭 兴，杨 洋，惠建权，石志发，吴有祥，欧明毅，李 琰*

烤烟醇化过程中的代谢物和脂质分析

黄桂红1，谢华利1，彭黔荣2，彭 兴1，杨 洋2，惠建权2，石志发2，吴有祥2，欧明毅2，李 琰1*

（1.深圳脉图精准技术有限公司，广东 深圳 518000；2.贵州中烟工业有限责任公司，贵阳 550009）

为探明烟叶醇化过程中代谢物和脂质的变化规律，本研究采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）和液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）相结合的方法对不同产地烟叶醇化过程中的化学成分进行了代谢组学和脂质组学分析。结果表明，醇化后的烟叶中糖类、氨基酸、脂质和核苷酸等初级代谢产物的相对含量减少，黄酮类、苯衍生物、酚类和萜类化合物等次级代谢产物则增加；进一步研究发现，上述初级代谢产物的变化随醇化时间（1～7年）的增加而递减，而次级代谢产物呈现逐年递增的趋势。同一品种云烟87（YY87）在不同产地（广东和湖南）之间化学成分差异较大，主要为氨基酸和膜脂，而醇化后差异减小。综上所述，代谢组学和脂质组学方法能有效区分醇化和非醇化烟叶，并且能揭示不同醇化程度烟叶的特征及不同产地对烟叶化学成分的影响。

代谢组学；脂质组学；烟叶；醇化；产地

烟草在世界范围内广泛种植，其生长对土壤、海拔高度、温度、降雨量和光照要求严格。因此，来自不同地理位置和品种的烟叶制成的卷烟具有独特的风味[1]。烟叶化学成分是评估烟草质量的主要指标，但鲜有采用经济、高效的方法尽可能多地对烟叶中的化学成分进行鉴定的研究。

代谢组学和脂质组学作为一种新兴的分析方法，可定性和定量分析生物的代谢物和脂质。该技术已应用于监测由于遗传[2]和环境因素[3]而引起的烟草代谢物的变化。LI等[4]开发出一种GC-MS方法，可通过检测44个代谢物区分来自津巴布韦和中国云南的烟叶。ZHAO等[5]通过GC-MS和毛细管电泳质谱（CE-MS）技术揭示了云南、河南和贵州烤烟中氨基酸（如苯丙氨酸、亮氨酸和酪氨酸）、糖类（如果糖、海藻糖和蔗糖）和抗氧化类物质（如奎宁酸、绿原酸和抗坏血酸）含量差异。

醇化是烟草生产的关键环节，其过程复杂，包括微生物作用、酶作用和化学反应[6-10]。在醇化过程中，微生物和酶由于其潜在的工业应用价值而引起了研究人员的广泛兴趣。王芳等[11]使用从茅台酒曲中提取的香气相关微生物处理不同部位的烟叶，发现烟叶中的香气成分随之升高。还有研究表明，酶处理可加速碳水化合物、含氮化合物和总挥发性生物碱的降解，最终缩短醇化时间[12]。

目前，通过代谢组学和脂质组学的方法研究烘烤和醇化过程中烟叶化学成分变化的报道较少，且目前文献中多采用单一方法（GC-MS或LC-MS），其定性的代谢物类型和数量均比较有限。本项目基于GC-MS和LC-MS相结合的方法对烟叶的代谢组和脂质组进行了检测分析，大大提高了极性代谢物和脂质的检测能力，并结合Fiehn数据库和自建数据库进行代谢物注释，增强了其鉴定能力。本文探讨了醇化与否、醇化时间和产地3个关键因素对烟草品质的影响，以期为烟叶开发和利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

甲醇、甲基叔丁基醚、乙腈、异丙醇和超纯水（质谱纯，德国Merck公司）。甲氧胺盐酸盐、N-甲基-N-（三甲基硅基）三氟乙酰胺（MSTFA）、吡啶、皮质醇、氨苄西林、13C山梨糖醇和磷脂酰胆碱[PC(17:0-14:1)]购自美国Sigma Aldrich公司。质量控制标准品也购自美国Sigma Aldrich公司，其中GC-MS所用标准品参考文献[13]，检测亲水性代谢物的超高效液相色谱-质谱联用仪（UPLC-MS）所用标准品包括脱落酸、壬二酸、儿茶素、赤霉素A3、甘氨酰苯丙氨酸、组氨酸、犬尿氨酸、烟酸、苯乙酰乙酸。检测亲脂性代谢物的UPLC-MS所用标准品SPLASH® LIPIDOMIX® Mass Spec Standard（330820L-1EA）购自美国Avanti公司。

1.2 样本

从贵州中烟工业有限责任公司收集到来自云南、贵州、河南和福建等地的片烟样品共19份。

1.3 试验方法

1.3.2 醇化时间对烤烟代谢组和脂质组的影响 来自贵州遵义地区同一类型的样本（表2），在室温分别醇化1～7年，每年取样1次，每次取3个重复。

表1 烟草样品信息

Tabel 1 Tobacco samples information

样本 IDSample ID产地Origin品种Variety存放时间/年Storage time/year是否醇化Aged or not RT_FJ_K326福建K3263是 RT_GZ_NA1贵州未知3是 RT_HN_YY87湖南云烟87（YY87）3是 RT_FJ_CB1福建翠碧一号（CB1）3是 RT_GD_YY87广东云烟87（YY87）3是 RT_HNS_ZY100河南中烟100（ZY100）3是 RT_LN_NA2辽宁未知3是 RT_YN_NA3云南未知3是 RT_YN_NA4云南未知3是 CT_FJ_K326福建K3263否 CT_GZ_NA1贵州未知3否 CT_HN_YY87湖南云烟87（YY87）3否 CT_FJ_CB1福建翠碧一号（CB1）3否 CT_GD_YY87广东云烟87（YY87）3否 CT_HNS_ZY100河南中烟100（ZY100）3否 CT_LN_NA2辽宁未知3否 CT_YN_NA3云南未知3否 CT_YN_NA4云南未知3否

表2 烟草样品醇化时间

1.4 烟叶代谢组和脂质组检测

1.4.1 样本制备 将每份样品的叶片按照表型性状（如：色泽、叶脉含量）进行分类，剪碎，去主支脉，再从不同分类的样品中取等份的碎片化的样品进行混合以减少试验误差，随机分成3份，制备均质样品。称取20 mg样本在液氮中快速冷冻，随后使用Retsch MM440均质机研磨成均匀粉末。参考文献[14]对均质样品进行极性代谢物和脂质提取。含有亲脂性代谢物（脂质）的上层转移到离心管中，用于UPLC-MS检测（C8-UPLC-MS）。含有亲水性代谢物（极性代谢物）的下层转移并分成2份，分别用于GC-MS和UPLC-MS检测（C18-UPLC-MS）。

1.4.2 分析条件 气相色谱质谱联用仪（GC-MS）分析：样品经衍生化后[13]，注入到配有Rxi®-5Sil MS色谱柱（Restek 30 m * 0.25 mm * 0.25 μm）的气相色谱系统（7890B，美国Agilent）和飞行时间质谱系统（PEGASUS-BT，美国Leco）检测。采用高纯度氦气用作载气，流速为1 mL/min。气相色谱升温程序为：初始温度50 ℃，保持2 min，15 ℃/min连续升温至330 ℃，保持2 min。进样口主要参数为：280 ℃，分流进样（10∶1）。质谱主要参数为：电子电离源（EI），温度250 ℃，电子能量70 eV；扫描范围50～500 amu，检测电压1.2 kV。

UPLC-MS极性代谢物/脂质分析：将干燥样品分别加入200 µL水（亲水性化合物）或乙腈/异丙醇混合液（/=7/3）（亲脂性化合物）重新溶解并上机。两台UPLC-MS包括Waters ACQUITY超高效液相色谱系统和Thermo Fisher Q-Exactive质谱仪，配置电喷雾电离源（ESI）。对于亲水性化合物分析，使用Waters ACQUITY HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）。对于亲脂性化合物，使用Waters ACQUITY BEH C8柱色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。流动相组成和ESI参数参考文献[15]。

1.4.3 质量控制 样本采用随机序列，在数据采集序列前中后均插入代谢物混合标准品和质控样本（QC），以确保仪器状态良好。QC样本由试验所使用的烟叶样本等量混合而成。

1.5 数据处理与统计分析

GC-MS的数据只保留峰高大于5000的特征峰，原始谱图进行基线校正并转换为通用数据表（NetCDF），导入到“R语言”（4.0版本）中分析。应用TargetSearch数据包[16]将保留时间转换为保留指数（RI），经过峰提取、峰对齐，最后使用Fiehn数据库进行注释[17]。

UPLC-MS的数据，仅保留峰高大于100 000的特征峰，并根据自建质谱数据库进行注释[18]。将质量准确度[19]低于6×10-6且保留时间（RT）偏差低于0.09 min的特征峰筛选保留用于下一步分析。

何谓统计量？它是指抽样统计中观察频数与期望频率之间可能存在着差异，统计量的基本想法是对每一个差取平方，然后除以期望频率再取和，就得到一个统计量，该统计量就称为统计量，即

数据按烟叶干质量进行均一化处理后，使用MetaboAnalyst 5.0（https://www.metaboanalyst.ca/）进行主成分分析（PCA），并用偏最小二乘判别分析法（PLS-DA）建立模型。PLS-DA通过置换试验进行验证。箱型图由MetaboAnalyst 5.0绘制导出，热图由Office Excel绘制。VIP > 1.5和方差分析<0.01的差异物质作为潜在生物标记物进行后续分析。

2 结 果

2.1 烟草代谢组学综合分析

对同一样品进行一次提取，同时使用GC-MS，C18-UPLC-MS和C8-UPLC-MS 三个平台共5次高通量检测（含LC平台的正负模式），提高了烟叶中极性代谢物和脂质的覆盖率。本试验共检测到7155个不同的特征峰，结合Fiehn数据库和自建数据库注释得到1039个代谢物，包括脂质、碳水化合物、氨基酸、核苷酸、参与能量代谢的代谢物和次级代谢产物，如黄酮类、苯丙烷类和萜类化合物（图1）。其中，C8-UPLC-MS平台检测到多类脂质，包括脂肪酸（FA）、甘油三酯（TAG）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和双半乳糖甘油二酯（DGDG）等。

2.2 醇化对烟叶代谢组的影响

由PCA图（图2）可看到，醇化3年的烟叶和冷库保存（非醇化）的同批烟叶代谢组虽有部分重叠（图2A），但总体呈分开的趋势。从PLS-DA模型（图2B）中可观察到醇化和非醇化烟叶组在图中分开（2和2分别为0.90和0.85，预测准确度为0.98）。

差异代谢物（VIP>1.5，<0.01）通过Classyfire（https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/）进行化学分类，并通过热图进一步分析发现（热图略，代表性差异物见图3），与非醇化烟叶相比，醇化烟叶中的大多数代谢物含量降低，例如：氨基酸（色氨酸、赖氨酸、丝氨酸）、核苷酸（鸟苷、脱氧腺苷、3'-AMP、3'-CMP等）、糖类（蔗糖、潘糖、甘露糖等）、多元醇（绿原酸、莽草酸）和黄酮苷（异牡荆素、槲皮素3-O-丙二酰葡萄糖苷）。而大多数黄酮类化合物（没食子儿茶素、杨梅素、大豆苷）、苯衍生物[4-（甲氨基）苯甲酸、2-氨基苯酚、龙胆酸等]、酚类（辛弗林、3,4-二羟基苄胺等）和新枞酸等次级代谢产物在醇化组中含量增加。上述结果说明，烟叶的代谢物组成在醇化过程中发生了极大变化，初级代谢产物和部分糖类物质的含量呈下降趋势，而多数次级代谢产物含量增加。

注：LP和LN分别表示C8-UPLC-MS在正离子和负离子模式下获得的数据。PP和PN分别代表C18-UPLC-MS在正离子和负离子模式下获得的数据。GC表示来自GC-MS的数据。

图2 醇化（RT）和非醇化（CT）烟叶的PCA（A）和PLS-DA（B）分析

注：y轴，log2转换结果。Note: Y axis, log2 conversion result.

2.3 醇化时间对烟叶代谢产物谱的影响

为了进一步比较不同醇化时间（1至7年）烟叶代谢谱的差异，将其代谢组学结果的差异通过PCA分析呈现出来（图4）。第一个主成分（PC1）贡献率占40.8%，可以区分醇化时间长短引起的化学成分变化，其中最大的组分变化发生在醇化第二年，之后变化幅度逐年减小。醇化5年及以上的样品，第二个主成分（PC2）表明其变化较前几年显著。潜在的原因可能是，与醇化4年或更短时间的样品相比，这些样品因放置较久，表面的微生物感染情况复杂。在收集样品过程中，观察到醇化10年的烟叶已经部分发霉（未放入试验组中）。此外，通过热图（略）比较了不同醇化时间对烟叶代谢产物谱的影响，结果显示（图5）与2.2发现的结果相似，核苷酸（2',3'-cCMP，3'-CMP）、糖类（潘糖，蔗糖）和脂质（PC 34:3）随醇化时间的增加而递减，而其他大部分物质，如酰基化氨基酸（N-甲酰天冬氨酸）、脂肪酸（木蜡酸）、酚类（3,4-二羟基苄胺）和苯类（2-氨基苯酚）等，则逐年递增。此结果结合感官评价有望指导最佳醇化时间的确定。

注：Y1-7，醇化时间1至7年。

图5 1至7年醇化的烟叶中部分有代表性差异代谢物的箱型图

从图6A中可以看出，脂质（TAG、PC、DGDG）随醇化时间的延长而逐渐减少，且TAG含量在第2年下降最快，DGDG次之，PC含量变化较缓慢。脂肪酸的含量（图6B）则随醇化时间的延长而增加。结果表明，TAG首先被消耗，其次是DGDG，最后是膜磷脂。

2.4 产地对烟叶代谢产物谱的影响

通过PCA分析展现了分别在广东（GD）和湖南（HN）栽培的同品种云烟87（YY87）烟叶在醇化前后的代谢差异（图7），其中PC1可区分醇化与否，PC2可区分产地（广东和湖南）。这种产地差异可归因于膜脂（如PC、PE、DGDG）、氨基酸、核苷酸和糖类（图8）。醇化前，非生物膜脂质（Non-membrane lipids）如TAG在广东和湖南中显示出微小差异（图8-9）；醇化后（图8），广东产地的烟叶膜脂（PC、PE、DGDG）含量无显著变化，而湖南产地的烟叶膜脂降低至与广东产地的相同水平，两地间膜脂的差异消失。该结果表明产地影响烟叶的代谢谱，而醇化使两地间的膜脂和氨基酸的含量差距缩小。

注：RT和CT分别表示醇化烟叶和非醇化烟叶。GD和HN分别表示来自广东和湖南的烟叶。

注：化合物名称中红色字体表示醇化后含量升高，蓝色表示含量降低。

3 讨 论

本研究采用GC-MS，C18-UPLC-MS和C8-UPLC-MS三个平台联合使用的方法，研究了不同醇化程度、醇化时间和产地对烟草代谢谱的影响，大大提高了所检测样品中代谢物的覆盖率。

对不同醇化程度烟叶的研究发现，赖氨酸、色氨酸等常见氨基酸，蔗糖、葡萄糖和甘露糖等还原糖显著减少，与前人的研究结果一致[20]。它们的减少与其自然氧化和微生物降解有关。在醇化过程中，氨基化合物和还原糖之间的非酶糖化反应会形成许多香气成分[21]。

在醇化烟叶中观察到核苷酸和碱基呈下降趋势。在死亡的生物体中，碱基胸腺嘧啶经常随着时间的推移而被氧化成乙内酰脲[22]。醇化烟叶中莽草酸含量显著降低，莽草酸是芳香族氨基酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的前体。酪氨酸可被代谢产生苯丙烷类化合物，进而形成黄酮、香豆素、单宁和木脂素。绿原酸是烟叶中的主要多酚，对香烟的香味有积极的贡献，其在醇化烟叶中的浓度降低可能是由于被氧化。

尼古丁含量是烟叶产品质量的一个重要指标。由本研究的结果观察到醇化后尼古丁浓度显著降低，与已有研究[23]一致。同时，尼古丁的前体物质烟酰胺和尼古丁的代谢产物伪氧尼古丁的相对含量也在醇化后显著降低。这证实醇化降低了烟叶中尼古丁和相关代谢物的含量。

图9 GD_YY87和HN_YY87之间差异脂质的箱型图

研究中所提及的黄酮类、苯类和酚类化合物广泛分布于植物中。经过醇化后，包括杨梅素、没食子儿茶素、大豆苷和香豆蔻素在内的大多数黄酮类化合物的含量显著增加。相反，黄酮苷、异牡荆素或芹菜素以及槲皮素3-O-丙二酰糖苷的含量在醇化后降低。在醇化过程中，黄酮类化合物的糖苷形式缓慢转化为苷元形式。

研究还比较了不同醇化时间对烟叶代谢产物谱的影响，结果显示酰基化氨基酸的含量逐年上升，此发现未在其他烟草文献中报道。蔗糖、潘糖和葡萄糖醛酸等糖类化合物的浓度逐年降低，而N-乙酰胞壁酸和葡萄糖醛酸-3,6-内酯呈现相反的趋势。N-乙酰胞壁酸作为细菌细胞壁中肽聚糖的关键成分，也是已知的细菌污染标志物。N-乙酰胞壁酸的相对浓度随着醇化时间的延长而增加，这证明醇化烟叶中存在细菌。

随着醇化时间的延长，TAG、PC、DGDG等脂质显著减少（图6A），而脂肪酸的浓度显示出相反的趋势（图6B），其浓度的增加可能是脂质降解的结果。TAG是一种有效的碳和能量存储形式，PC和PE是植物细胞膜中两种常见的磷脂[24]，它们会逐渐被水解或氧化。这些反应可在光、热、酶和/或微生物的存在下被催化，TAG分解为甘油和脂肪酸[25]，这就解释了TAG减少和脂肪酸增加的原因。DGDG、MGDG等半乳糖脂是植物光合类囊体膜中含量最丰富的脂质[26]。结果表明，烟叶醇化过程中TAG首先被消耗，其次是DGDG，最后是膜磷脂，该发现在本文中首次提出，具体机理有待更进一步研究。

郑庆霞等[27]曾发现产地对烟草的代谢谱的影响甚至大于品种对代谢谱的影响，但并未深入研究其影响的具体物质。本研究发现在不同产地（湖南和广东）的同一品种烟叶（云烟87）所表现出的化学成分差异主要在于膜脂（如PC、PE、DGDG）、氨基酸、二肽、核苷酸和糖类。

4 结 论

结果表明，醇化加工和产地不同对烟叶的代谢产物有较大影响。在醇化样品中，氨基酸（色氨酸、赖氨酸、丝氨酸）、核苷酸（腺苷、脱氧腺苷、3'-AMP、3'-CMP等）、糖类（蔗糖、潘糖、甘露糖等）和多元醇（绿原酸、莽草酸）、黄酮苷（异牡荆素或芹菜素、槲皮素3-O-丙二酰葡萄糖苷）的含量减少，而大多数黄酮类化合物（没食子儿茶素、杨梅素、大豆苷）、苯类[4-（甲氨基）苯甲酸）、2-氨基苯酚、龙胆酸等]、酚类（辛弗林、3,4-二羟基苄胺等）和新枞酸等萜类化合物含量增加。醇化时间延长可以进一步增强这些影响。此外，不同产地的烤烟叶的代谢特征存在明显差异。代谢组学和脂质组学可用于研究不同产地和醇化时间对烟草产品的代谢特征的影响，从而将这些发现应用到烟叶加工和香烟制备工艺评估和优化中。

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Metabolite and Lipid Profiling of Flue-cured Tobacco Leaves during Aging

HUANG Guihong1, XIE Huali1, PENG Qianrong2, PENG Xing1, YANG Yang2, HUI Jianquan2, SHI Zhifa2, WU Youxiang2, OU Mingyi2, LI Yan1*

(1. Metanotitia Co., Ltd, Shenzhen, Guangdong 518000, China; 2. The Technology Center of China Tobacco Guizhou Industry Co., Ltd, Guiyang 550009, China)

In order to explore the metabolic and lipidomic changes of tobacco leaves during aging, an integrated analytical approach using both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) was used to chemically profile flue-cured tobacco leaves from different origins. The results showed that primary metabolites such as carbohydrates, amino acids, lipids, and nucleotides decreased significantly in tobacco leaves after aging, however, increased abundance of secondary metabolites including flavonoids, benzenoids, phenols, and terpenoids was observed. Additionally, during the aging time of 1 to 7 years, the above mentioned primary metabolites continuously decreased with the extension of aging time, while the secondary metabolites showed an opposite trend. The cultivar YY87, which was cultivated in Guangdong and Hunan, showed great chemical compositional differences atdifferent cultivation origins. These differences were attributed to amino acids and membrane lipids, however, the differences decreased after aging. In conclusion, the metabolomics and lipidomics methods can effectively distinguish aged and non-aged tobacco leaves, reveal the characteristics of tobacco leaves with different aging degrees, and the effects of different producing areas on the chemical composition of tobacco leaves.

metabolomics; lipidomics; tobacco leaves; aging; origin

TS41+1

A

1007-5119（2022）03-0078-09

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.03.012

黄桂红（1990-），女，硕士，研究方向为代谢组学。E-mail：guihong.huang@metanotitia.com。

，E-mail：yan.li@metanotitia.com

2021-10-15

2022-01-24