香菇多糖对肥胖小鼠脂肪炎症和糖脂代谢的改善作用

陈 溢，朱彬彬，郑明选，孙芬芬，张 悦，刘永佳，于英华，潘 伟，杨晓莹

肥胖除其自身危害外，还可增加高血压、糖尿病、癌症和阿尔茨海默病等疾病的发病风险[1-2]，然其目前仍缺乏理想的干预策略。

β-葡聚糖(β-glucan)是一种可酵解的膳食纤维。研究[3]显示，长期食用真菌来源的几丁质-葡聚糖(含有1,3-β-glucan)改善高脂饮食小鼠的代谢异常，降低小鼠体质量和血清三酰甘油含量，改善小鼠葡萄糖耐受。香菇多糖(Mushroom)是一种来源于香菇的β-(1→3，1→6)-glucan[4]。前期研究[5]表明，Mushroom可改善高脂饮食小鼠的认知功能障碍，但其对小鼠脂肪组织的影响鲜有报道。该实验利用高脂饮食诱导的肥胖小鼠，探讨Mushroom对肥胖小鼠脂肪组织炎症和糖脂代谢的影响，为后期研究Mushroom对机体糖脂代谢紊乱及炎症反应的调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器香菇多糖(河南远业生物科技有限公司)；TRIzol试剂盒、逆转录试剂盒和荧光定量酶(南京诺唯赞生物科技有限公司)；Bio-Rad电泳系统和荧光定量PCR仪(美国伯乐生命医学公司)；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司)；引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)；肉碱棕榈酰转移酶-1A (carnitine palmitoyl transferase-1A, CPT-1A)、PK、β-actin抗体(美国Cell Signaling公司)；相应二抗、ECL显影剂和BCA试剂盒(上海碧云天生物技术公司)。

1.2 方法

1.2.1实验动物与分组 30只9周龄C57Bl/6J雄性小鼠购自徐州医科大学实验动物中心[生产许可证编号：SCXK(Su)2015-0009]，均在SPF实验室条件下饲养(温度22 ℃，12 h/12 h光照/黑暗周期)。小鼠随机平均分为3组：正常饮食组(LF组)，高脂饮食组(HF组)，高脂饮食+Mushroom干预组(HF+Mushroom组)。LF组小鼠喂养正常日粮(含5%脂肪)；HF组小鼠喂养高脂日粮(含30%脂肪)；HF+Mushroom组小鼠在高脂日粮中添加500 mg/kg的Mushroom。3组小鼠分别持续喂养15周。

1.2.2样品采集 采样前小鼠称重，10%水合氯醛麻醉处死小鼠。取皮下白色脂肪和附睾白色脂肪并称重。部分组织用4%多聚甲醛固定，剩余样本置于-80 ℃冻存备用。

1.2.3实时定量荧光PCR分析 用TRIzol试剂盒提取皮下和附睾白色脂肪组织的总RNA，用反转录试剂盒将RNA逆转为cDNA。设计目的基因和内参基因β-actin的引物序列(表1)，包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1-α，HIF-1α)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator activated receptor α，PPARα)、CPT-1A、细胞色素P450 4A10酶(cytochrome P450 4a10，CYP4a10)、中链酰基辅酶A脱氢酶(medium-chain acyl-coenzyme a dehydrogenase，MCAD)等。SYBR Green Real-time PCR Master Mix试剂盒检测基因的mRNA表达。

表1 PCR引物序列

1.2.4Western blot分析 提取小鼠脂肪组织总蛋白，用BCA试剂盒测定其蛋白浓度。在10%SDS-PAGE中通过电泳分离蛋白质，然后使用Bio-Rad电泳系统将分离的蛋白质转至PVDF膜上，5% BSA封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，二抗室温孵育1 h后，TBST洗涤3次，ECL显色。使用Quantity ONE软件对条带进行扫描和分析。

1.2.5苏木精-伊红(HE)染色 将小鼠皮下和附睾脂肪组织在4%多聚甲醛中固定24 h，脱水、石蜡包埋后切片，参照HE染色试剂盒的方法进行HE染色，光学显微镜下观察脂肪组织的形态结构，并用Image J软件分析脂肪细胞大小。

2 结果

2.1 体质量、脂肪组织称重及组织学观察HF组小鼠体质量高于LF组,HF+Mushroom组小鼠体质量低于HF组，差异有统计学意义(F=36.63，P<0.01，图1A)。HF组小鼠皮下白色脂肪质量高于LF组，而HF+Mushroom组脂肪质量低于HF组，差异有统计学意义(F=65.02，P<0.01，图1B)。HF组小鼠附睾白色脂肪组织质量高于LF组，而HF+Mushroom组脂肪质量低于LF组，差异有统计学意义(F=32.76，P<0.01，图1C)。HE染色显示，HF组小鼠皮下白色脂肪组织的脂肪细胞大于LF组，而HF+Mushroom组脂肪细胞小于HF组，差异有统计学意义(F=160.7,P<0.01，图1D)。HF组小鼠附睾白色脂肪组织的脂肪细胞大于LF组，而HF+Mushroom组的脂肪细胞小于HF组，差异有统计学意义(F=101.6，P<0.01，图1E)。

图1 Mushroom对高脂饮食小鼠体质量、脂肪组织质量及脂肪细胞大小的影响

2.2 促炎因子的mRNA表达情况实时定量荧光PCR分析法检测小鼠皮下白色脂肪组织，HF组促炎因子TNF-α的mRNA水平高于LF组，而HF+Mushroom组TNF-α的表达低于HF组，差异有统计学意义(F=23.09，P<0.01，图2A)；HF组促炎因子IL-6的mRNA表达较LF组升高，而HF+Mushroom组IL-6表达低于HF组，差异有统计学意义(F=20.29，P<0.01，图2A)；与LF组促炎因子MCP-1的mRNA水平相比，HF组MCP-1表达上调，而HF+Mushroom组MCP-1表达低于HF组，差异有统计学意义(F=31.17，P<0.01，图2A)。检测小鼠附睾白色脂肪组织，HF组TNF-α的mRNA水平高于LF组，而HF+Mushroom组TNF-α表达低于HF组，差异有统计学意义(F=5.935，P<0.01，图2B)；HF组IL-6 的mRNA水平高于LF组，而HF+Mushroom组IL-6表达低于HF组，差异有统计学意义(F=15.37，P<0.01，图2B)；HF组MCP-1的mRNA水平较LF组升高，而HF+Mushroom组MCP-1表达低于HF组，差异有统计学意义(F=9.660，P<0.01，图2B)。

图2 Mushroom对高脂饮食小鼠脂肪组织促炎细胞因子mRNA表达水平的影响

2.3 巨噬细胞的活化情况实时定量荧光PCR分析法检测小鼠皮下白色脂肪组织，如图3所示，HF组CD68的mRNA表达水平高于LF组，HF+Mushroom组CD68的mRNA表达水平低于HF组，差异有统计学意义(F=12.75，P<0.01)；HF组iNOS的mRNA表达量高于LF组，HF+Mushroom组iNOS的mRNA表达水平高于HF组,差异有统计学意义(F=7.110，P<0.01)；HF组Arg1表达水平低于LF组，HF+Mushroom组Arg1的mRNA表达水平高于HF组，差异有统计学意义(F=17.25，P<0.01)。

图3 Mushroom对高脂饮食小鼠皮下白色脂肪组织巨噬细胞活化相关因子mRNA表达水平的影响

2.4 糖酵解通路的mRNA表达情况实时定量荧光PCR分析法检测小鼠皮下白色脂肪组织，HF组PK的mRNA表达水平高于LF组，HF+Mushroom组PK 的mRNA表达水平低于HF组，差异有统计学意义(F=9.517，P<0.01，图4A)；HF组PFK的mRNA表达水平高于LF组，HF+Mushroom组PFK 的mRNA表达水平低于HF组，差异有统计学意义(F=14.44，P<0.01，图4A)；与LF组相比，HF组HIF-1α的mRNA水平上调,HF+Mushroom组HIF-1α的mRNA水平低于HF组，差异有统计学意义(F=13.65，P<0.01，图4A)。检测小鼠附睾白色脂肪组织结果显示，HF组PK的mRNA表达水平高于LF组，HF+Mushroom组PK的mRNA表达水平低于HF组，差异有统计学意义(F=8.708，P<0.01，图4B)；HF组PFK的mRNA表达水平高于LF组，HF+Mushroom组PFK的mRNA表达水平低于HF组，差异有统计学意义(F=15.32，P<0.01，图4B)。

图4 Mushroom对高脂饮食小鼠脂肪组织糖酵解通路相关因子mRNA表达水平的影响

2.5 脂肪酸氧化通路的mRNA表达情况实时定量荧光PCR分析法检测小鼠皮下白色脂肪组织，如图5所示，HF组PPARα的mRNA水平低于 LF组，HF+Mushroom组PPARα的mRNA水平高于HF组，差异有统计学意义(F=8.844，P<0.01)；HF组CPT-1A的mRNA水平低于 LF组，HF+Mushroom组CPT-1A的mRNA水平高于HF组，差异有统计学意义(F=87.90，P<0.01)；与LF组相比，HF组MCAD的mRNA水降低, HF+Mushroom组MCAD的mRNA水平较HF组升高, 差异有统计学意义(F=10.74，P<0.01)；HF组CYP4a10的mRNA水平低于 LF组，HF+Mushroom组CYP4a10的mRNA水平高于HF组，差异有统计学意义(F=12.26，P<0.01)。

图5 Mushroom对高脂饮食小鼠皮下白色脂肪组织中脂肪酸氧化相关因子mRNA表达水平的影响

2.6 糖酵解和脂肪酸氧化通路的蛋白表达情况Western blot法检测小鼠皮下白色脂肪组织显示，HF组PK的蛋白表达水高于LF组，HF+Mushroom组PK的表达水平则低于HF组，差异有统计学意义(F=6.642，P<0.05)。与LF组相比，HF组的CPT-1A的蛋白表达水平降低；而HF+Mushroom组CPT-1A的表达水平较HF组升高，差异有统计学意义(F=100.7，P<0.01)。见图6。

图6 Mushroom对高脂饮食小鼠皮下白色脂肪组织糖酵解和脂肪酸氧化通路的蛋白表达水平的影响

3 讨论

该研究通过高脂饮食建立小鼠肥胖模型，探讨香菇多糖对肥胖小鼠脂肪炎症和糖脂代谢的影响。结果显示，香菇多糖可以降低小鼠体质量与脂肪质量，减少脂肪细胞面积，这与前人报道[6]一致；此外，香菇多糖可明显改善脂肪组织的炎症以及糖脂代谢紊乱。这些结果表明，香菇多糖具有肥胖干预潜力。

肥胖可诱导脂肪组织分泌TNF-α和IL-6等促炎因子[7-9]，加剧体内炎症反应，降低肝脏等组织对胰岛素的敏感性，进而促进肥胖相关代谢综合征进展[10]。该研究显示高脂饮食小鼠皮下及附睾促炎因子TNF-α、IL-6和MCP-1表达含量升高，而香菇多糖可下调这些因子的表达。上述研究结果表明香菇多糖可抑制小鼠脂肪组织炎症改善肥胖。

巨噬细胞(macrophages，Mø)是重要的固有免疫细胞，根据其功能，分为以分泌TNF-α、IL-1β等促炎细胞因子为主的M1型Mø和以分泌IL-10等抗炎细胞因子为主的M2型Mø[11]。CD68、iNOS是M1型Mø的表达标志物，而Arg1是M2型Mø的表达标志物。该研究结果显示，肥胖小鼠脂肪组织以M1型Mø为主，而香菇多糖干预可抑制M1型Mø极化。这提示香菇多糖可改善Mø介导的代谢性炎症，从而有助于改善肥胖及其相关的代谢综合征。

M1型Mø细胞依赖于糖酵解过程提供能量，且存在三羧酸循环反应的中断和氧化磷酸化的功能损伤，进而导致炎性前列腺素的产生和TNF-α、IL-6等促炎细胞因子的分泌，最终引发脂肪组织炎症，加剧代谢性疾病的发展进程[12]。PK和PFK是糖酵解途径中的两大关键酶。而HIF-1α与氧化应激、炎症的发展关系密切[13]。该研究表明肥胖小鼠脂肪组织中PK、PFK和HIF-1α的表达水平上升，而香菇多糖可以下调其表达量，提示香菇多糖可通过抑制糖酵解通路，改善炎症情况。

脂肪合成与脂肪分解的平衡共同促成了脂质代谢。PPARs是配体诱导型转录因子的核受体家族，可诱导参与能量稳态和炎症途径的基因表达[14]。PPARα调节参与脂肪酸β-氧化的基因的表达，诱导PPARα激动可以促进脂肪酸氧化分解。CPT-1A和MCAD分别为脂肪酸β氧化的限速酶。CYP4a10可催化中长链脂肪酸和前列腺素的ω-羟基化，有文献[15]报道CYP4a10可抑制小鼠体内炎症反应。该研究显示肥胖小鼠脂肪组织PPARα、CPT-1A、MCAD和CYP4a10表达量均下降，而香菇多糖可上调其表达，可能有助于促进脂肪细胞内脂肪酸氧化分解，减少体内脂肪蓄积，改善小鼠肥胖。