IL-6在对乙酰氨基酚肝损伤后再生中的作用

郁福乾，宋莎莎，路 燕，章礼久

药物性肝损伤(drug-induced liver injury,DILI)是指由药物和(或)其代谢产物引起的肝脏损伤，其发病率近年来呈上升趋势，目前已是中国非感染性肝病的第2大病种[1]。其中以对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)过量诱导的急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)最为常见[2-3]。在肝脏损伤及修复再生过程中，炎症反应起至关重要的作用。炎症诱导的再生主要由炎症细胞释放的各种细胞因子和生长因子调控，目前研究较多的促炎细胞因子是白细胞介素(interleukin,IL)-6和肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor,TNF)-α[4]。体内研究表明IL-6和TNF-α在炎症反应早期介导肝损伤，但在后期能够促进肝脏再生[5-6]。该研究旨在通过体外实验探讨IL-6在APAP所致急性肝损伤(acute liver injury,ALI)后肝再生过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂小鼠正常肝细胞AML12 细胞系由安徽医科大学毒理学实验室赠予；APAP购自美国MedChemExpress公司；CCK-8试剂盒购自武汉Elabscience公司；IL-6中和抗体、地塞米松购自美国Thermo公司；磷酸化信号传导子及转录激活子3(p-STAT3)抗体购自美国Santa Cruz公司；信号传导与转录激活因子3(STAT3)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、增殖细胞核抗原(PCNA)、肝细胞生长因子(HGF)抗体均购自美国CST公司；IL-6 ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司；特异性引物购自上海生工生物公司；PCR相关试剂购自上海新贝生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 将小鼠正常肝细胞AML12培养在DMEM/F-12 培养基[含10% 胎牛血清、1%胰岛素-转铁蛋白-硒 (insulin-transferrin-selenium,ITS)、0.5‰地塞米松及1%青-链霉素]中，37 ℃、5%CO2培养箱中进行孵育，培养1～2 d细胞融合达85%左右时传代。

1.2.2CCK-8实验 取对数生长期AML12细胞，细胞重悬后调整细胞密度为7.5×104个/ml，96孔板每孔加入100 μl细胞悬液，细胞贴壁后PBS漂洗2次，96孔板倒置滤纸上吸净水分，分别加入不同终浓度APAP(0、1、2.5、5、10、20 mmol/L)作用4、12 、24 及48 h，观察APAP对AML12细胞活力的影响，筛选出最适构模药物浓度。

操作同前，分别加入不同终浓度(0、0.01、0.1、1、10 μg/ml)IL-6中和抗体作用48 h，观察其对AML12细胞活力的影响。空白对照孔均加入100 μl培养基，每组设置5个复孔，加入CCK-8试剂10 μl孵育90 min，酶标仪450 nm波长测定各孔吸光度值，重复3次实验。细胞活力的计算公式：细胞活力(%) = (实验组OD值-空白对照组OD值)/(对照组OD值-空白对照组OD值) ×100%。

1.2.3Western blot实验 取对数生长期AML12细胞，细胞重悬后均匀接种于6孔板中，每孔加100 μl RIPA裂解液(含1%蛋白酶抑制剂+1%磷酸酶抑制剂)冰上裂解蛋白，4 ℃、13 200 r/min、25 min。BCA法测定蛋白浓度，加入SDS上样缓冲液，100 ℃煮沸10 min，-20 ℃冻存。等量蛋白在10% SDS-PAGE凝胶上恒压电泳，恒流转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗膜。一抗(β-actin：1 ∶10 000；PCNA:1 ∶500；p-STAT3、STAT3、CyclinD1、HGF均为1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，二抗(山羊抗小鼠IgG 1 ∶10 000、山羊抗兔IgG 1 ∶10 000)室温孵育1 h，TBST洗膜，超敏ECL发光显影剂显影，Tanon化学发光显影仪曝光条带并拍摄图片，Image J软件定量分析目的条带吸光度值。

1.2.4qRT-PCR实验 6孔板每孔加TRIzol试剂1 ml，提取细胞RNA用分光光度计测定RNA浓度。根据说明书操作，RNA定量2 μg逆转录，加入×8 gDNA remover 2 μl，DEPC水补足体积至16 μl，混匀42 ℃水浴加热2 min，随后加入×5 RT SuperMix 4 μl。取逆转录产物cDNA 1 μl，预混引物0.8 μl，DEPC水8.2 μl以及×2 S6 Universal SYBR qPCR Mix 10 μl配成总体积20 μl。扩增用LightCycle-480 PCR仪(Roche，version 1.5.0)，95 ℃预变性2 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，循环40次，95 ℃、5 s，65 ℃、5 s，通过熔解曲线分析来检测PCR扩增产物质量，按 2-ΔΔCt法计算增殖相关基因相对比值。特异性引物序列见表1。

表1 目的基因引物序列

2 结果

2.1 APAP对AML12细胞活力的影响采用CCK-8法测定APAP对AML12细胞活力的影响。与0、1、2.5 mmol/L组比较，5、10、20 mmol/L组在4 h细胞活力均出现了不同程度的降低(P<0.05)。与 4 h APAP组比较，12 h APAP组细胞活力升高，而24 h和48 h细胞活力持续下降，细胞活力在12 h达到峰值。在48 h，相较于10、20 mmol/L组，5 mmol/L组细胞活力较高，且细胞活力超过50%。因此，选择5 mmol/L药物浓度构建体外APAP诱导的ALI模型。见图1。

图1 CCK-8检测APAP对AML12细胞活力的影响

2.2 APAP对AML12细胞中IL-6浓度的影响在预实验中，使用了ELISA试剂盒测量IL-6浓度，0、4、12、24、48 h IL-6浓度分别为0、1.794、2.264、1.658、1.086 pg/ml(F=560.6)。见图2。

图2 APAP对AML12细胞中IL-6浓度的影响

2.3 IL-6Ab对AML12细胞活力的影响根据说明书介绍，抑制重组小鼠IL-6(0.25 ng/ml)诱导的细胞增殖需要的中和抗体浓度，50%中和作用浓度通常为0.005～0.025 μg/ml，为筛选合适的IL-6中和抗体浓度，设计5个不同浓度梯度0、0.01、0.1、1、10 μg/ml，作用细胞48 h，观察细胞活力。与0 μg/ml组比较，0.01 μg/ml组细胞活力(96.93±3.33)%，差异无统计学意义(P>0.05)，对细胞增殖无明显抑制作用；0.1、1、10 μg/ml组细胞活力分别为(94.33±2.69)%、(94.52±6.94)%、(94.59±6.65)%，差异有统计学意义(P<0.05)，此3组间差异无统计学意义(P>0.05)，故选取0.01 μg/ml浓度进行后期实验。见图3。

图3 CCK-8法检测IL-6Ab对AML12细胞活力的影响与0 μg/ml组比较：*P<0.05

2.4 APAP、IL-6Ab对AML12细胞CyclinD1、PCNA、HGF等蛋白表达的影响选取0、4、12、24、48 h 时间点，了解PCNA、CyclinD1、HGF等蛋白的表达情况。与APAP处理细胞其他时间点比较，4 h APAP组CyclinD1蛋白水平最高，12 h APAP组PCNA、HGF蛋白水平最高，差异均有统计学意义(F=700.80、2 016.00、14.48)(图4A、F、G、H)。

为探索IL-6在ALI后过程中的作用，在预定的时间点观察IL-6Ab在肝损伤后不同阶段对肝细胞增殖过程的调控作用。根据前期实验结果，在4 h检测CyclinD1、STAT3、p-STAT3蛋白水平，12 h检测PCNA、HGF再生相关指标的蛋白水平。与NC组比较，IL-6 Ab组p-STAT3、CyclinD1、PCNA、HGF蛋白表达差异均无统计学意义，4 h APAP组p-STAT3蛋白水平表达升高(图4B)，4 h APAP组CyclinD1蛋白水平表达减低(图4C)，与4 h APAP组比较，4 h APAP+IL-6 Ab组p-STAT3、CyclinD1蛋白表达均降低，差异有统计学意义(F=248.7、1 805.0)(图4I、J)。与NC组比较，12 h APAP组PCNA蛋白水平表达升高(图4 D)，HGF蛋白水平表达升高(图4E)，与12 h APAP组比较，12 h APAP+IL-6 Ab组PCNA、HGF蛋白表达均降低，差异有统计学意义(F=110.30、37.84)(见图4 K、L)。

图4 APAP、IL-6Ab对AML12细胞CyclinD1、PCNA、HGF等蛋白表达的影响

2.5 APAP、IL-6Ab对AML12细胞中IL-6、CyclinD1、PCNA mRNA的影响为探索IL-6在ALI后过程中的作用，选取0、4、12、24、48 h 时间点，了解IL-6及PCNA等mRNA水平。与APAP处理AML12细胞其他时间点比较，4 h APAP组IL-6、PCNA 、CyclinD1 mRNA水平达高峰,差异均有统计学意义(F=15.07、413.40、66.29，P<0.05)(图5A、B、C)。与4 h APAP组比较，4 h APAP+IL-6 Ab组PCNA 、CyclinD1 mRNA水平降低，差异均有统计学意义(F=88.120、5.671，P<0.05)(图5D、E)。

图5 APAP、IL-6Ab对AML12细胞中IL-6、CyclinD1、PCNA mRNA的影响

3 讨论

IL-6是一种多功能性细胞因子，通过调节适应性免疫，对炎症、肝再生、抗感染等具有多种作用[5]。炎症在肝脏疾病的触发、进展及预后中扮演了重要作用。有研究[4]报道药物诱导的肝细胞损伤会引发炎症级联反应或免疫反应。体内研究显示，APAP过量时肝小叶发生中心性坏死，坏死细胞释放促炎物质引起急性炎症反应从而导致二次损伤。细胞水平研究显示，APAP起初诱导肝细胞死亡，后激活固有免疫触发炎症反应从而促进受损肝脏再生。DILI动物模型研究表明炎症在早期阶段诱导肝损伤，而后期阶段则促进肝脏再生[7]。IL-6介导的信号通路对早期肝损伤以及再生过程的进展和维持至关重要。目前关于DILI后细胞水平上肝再生过程研究尚少，体外实验[8]表明，IL-6对细胞炎症反应无明显调控作用。

炎性细胞因子通过激活一系列转录因子调控细胞周期，从而促进细胞增殖[9]。细胞周期包括G1、S、G2、M和G0期。IL-6促进肝细胞从G0过渡到G1和S期，其对肝细胞的直接作用导致STAT3二聚化和核移位。在细胞核中，IL-6激活与有丝分裂相关的早期基因，其靶向作用于CyclinD1和p21分子调节肝细胞增殖，保护细胞免受氧化应激反应、减少细胞死亡。CyclinD1在细胞由G1进入S期的过程中发挥重要作用，其表达仅受STAT3调控。在G1早期，CyclinD1水平升高，后急剧下降，这与大多数细胞中S期的开始相吻合。PCNA在S期表达升高，其表达与G1/S中的增殖峰值紧密相关，并在细胞周期结束时降低[10]。PCNA和CyclinD1之间的相互作用可阻止G1期DNA的提前合成。在G1向S期转变过程中，CyclinD1水平降低引起PCNA从复合物中释放，并导致染色体DNA复制的启动[11]。

该研究结果表明，APAP作用4 h后，5、10、20 mmol/L组细胞活力均出现不同程度的降低，提示细胞在4 h内出现损伤，这一结果与Preeti et al[12]研究结果相符。APAP给药12 h细胞活力达到峰值，推测细胞在12 h出现了损伤后的再生，而24 h和48 h细胞活力持续下降，这可能与药物持续作用于细胞导致损伤超过细胞再生的能力有关，且培养基中的营养物质逐渐消耗及有害物质积累。0、4、12、24、48 h IL-6浓度均较低，但呈现出浓度差异的变化，推测较低浓度的IL-6即可引起肝细胞后续的再生反应。在CCK-8实验筛选合适的IL-6 Ab作用浓度时，与0 μg/ml组比较，0.01 μg/ml组细胞存活率为(96.93±3.33)%，提示0.01 μg/ml IL-6 Ab对正常细胞无明显影响。

此外，PCNA、HGF蛋白水平在12 h最高，其升高时间与CCK-8细胞活力变化趋势一致。而CyclinD1蛋白水平在4 h最高，其表达时间先于PCNA、HGF，这一结果与细胞周期蛋白的时间差异性程序性表达理论相符。有报道[13]指出，在阿霉素药物体外刺激细胞增生模型中，细胞内CyclinD1蛋白水平在4、8 h升高，至12 h恢复到基线水平，这一结果与该研究结果相似，据此推测细胞再生的时间点可能在12 h。HGF通过激活继发性或延迟性基因应答，刺激DNA复制并诱导肝细胞增殖[14]。与NC组比较，4 h APAP组CyclinD1蛋白水平稍减低，与4 h APAP组相比，4 h APAP+IL-6 Ab组表达减低；与NC组比较，12 h APAP组PCNA、HGF蛋白水平升高，与12 h APAP组比较，12 h APAP+IL-6 Ab组表达减低。各组比较，STAT3总蛋白无改变；与NC组比较，4 h APAP组p-STAT3蛋白表达升高，与4 h APAP组比较，4 h APAP+IL-6 Ab组表达减低，表明IL-6 Ab通过中和IL-6从而抑制了STAT3磷酸化。据此推测IL-6 Ab通过中和IL-6不会改变STAT3总蛋白水平，但是能减低p-STAT3水平，从而抑制肝再生相关蛋白的表达。

qRT-PCR实验表明，在4 h APAP组，IL-6、PCNA、CyclinD1 mRNA水平达高峰，提示IL-6可能在此时驱动了细胞周期的进展，促进细胞DNA合成，为细胞分裂活动做准备。与4 h APAP组比较，4 h APAP+IL-6 Ab组PCNA、CyclinD1 mRNA水平降低。以上结果表明，IL-6 Ab通过中和IL-6抑制STAT3磷酸化，进而降低再生相关基因表达水平。