槲皮素包合物的制备与水溶性研究

盘振杰，杨敏芬，郭洋洋，张贞发，王 强

（广西民族师范学院 化学与生物工程学院，广西 崇左 532200）

槲皮素（Quercetin）作为一种在植物中分布比较广泛的天然膳食类黄酮化合物[1]，是一种黄色针状结晶体，化学名为3,3’,4’5,7-五羟基黄酮，具有抑菌、防炎、抗癌、减缓氧化、止咳祛痰、平缓血压等生理功能和药理作用[2-5]。β-环糊精（β-Cyclodextrin，β-CD）及其衍生物具有特殊的结构和两亲性，据此弥补β-CD本身水溶性低、键合能力差和生物利用度低等缺陷，可提高β-CD在水溶液中的溶解度[6-9]。本研究通过β-CD合成其衍生物，并对槲皮素进行包合得到包合物，增强槲皮素的生物活性；用红外光谱（Infrared Radiation，IR）、扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）对其进行表征，通过紫外线（Ultraviolet，UV）测定包合物结合常数和水溶性。

1 实验方案及方法

1.1 实验仪器和试剂

仪器：集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S）、隔膜真空泵、电热鼓风干燥箱（DHG-9140A）、紫外-可见分光光度计（UV-6102S）、傅里叶变换红外光谱仪等；试剂：β-CD、丙酮、对甲苯磺酰氯、1,3-丙二胺、N,N’-双(3-氨丙基)乙二胺、槲皮素、甲苯磺酸盐（Tosylate，实验室制得）等。

1.2 N,N’-双(3-氨丙基)乙二胺修饰β-CD（H1）的合成

量取10 mL N,N’-双(3-氨丙基)乙二胺与2.00 g Tosylate混合并溶解，升温至75 ℃，反应8 h，冷却后将上述反应液缓慢滴加到丙酮中，出现大量白色絮状物，抽滤后得到固体，置于真空干燥箱中，50 ℃干燥得到粉末，即H1，产率约为18.15%。用相同的方法合成H2，产率约为17.55%。

1.3 H1/槲皮素包合物的制备

称取26.91 mg H1，用3 mL水溶解；将19.31 mg槲皮素溶于3 mL无水乙醇。将两种溶液置于反应器中，在45 ℃条件下缓慢搅拌4～6 h。反应液置于真空干燥箱中干燥，得到固体。用水溶解固体，溶液用0.45 μm纤维素膜过滤，得到滤液。滤液放在真空干燥箱中45 ℃烘干，得到的褐色固体即H1/槲皮素包合物。用相同的方法制得H2/槲皮素包合物，固体为褐色。

1.4 客体-槲皮素标准工作曲线的绘制

采用UV建立客体-槲皮素的标准工作曲线，配制一系列浓度梯度的槲皮素乙醇溶液，再测定其吸光度（Absorbance，Abs）。称取1.50 g槲皮素，用少量乙醇溶解于小烧杯中，转移定容（溶剂为无水乙醇）到10 mL容量瓶中，得到5.0×10-4mol/L标准溶液。取7个5 mL容量瓶，分别加入不同量上述标准溶液并用无水乙醇定容，得到浓度分别为0.8×10-5、1.6×10-5、2.4×10-5、3.2×10-5、4.0×10-5、4.8×10-5、5.6×10-5mol/L的槲皮素溶液，分别测其Abs。

1.5 结合常数的测定

采用紫外光谱法分别测定并计算H1、H2与槲皮素之间的稳定常数。配制10 mL 0.5 mmol/L的H1溶液；称取6.50 mg，用4 mL水溶解，再加6 mL无水乙醇定容于10 mL容量瓶中，得到0.5 mmol/L的H1溶液；同上所述步骤得H2溶液。取10支干燥的5 mL容量瓶，每个瓶中都加入200 μL上述槲皮素标准溶液，再依次加入不同体积的主体溶液，用无水乙醇与水的混合溶液（V无水乙醇∶V水=3∶2）定容，配制成一定浓度梯度的主-客体乙醇水溶液，浓度分别为0.6×10-5、1.2×10-5、1.8×10-5、2.4×10-5、3.0×10-5、3.6×10-5、4.2×10-5、4.8×10-5、5.4×10-5、6.0×10-5mol/L，再分别测其Abs。

1.6 包合物水溶性的测定

采用饱和水溶液法测定包合物的水溶性，取过量槲皮素放入装有100 μL蒸馏水的带盖小离心管中，盖好盖子充分振荡；再称取过量H1/槲皮素包合物和H2/槲皮素包合物分别溶于100 μL水中，振荡后恒温放置2 h，分别制得饱和溶液；放置一段时间，分别取一定量的上层清液，定容于5 mL容量瓶中（溶剂为水），稀释到一定浓度梯度的溶液即待测液，分别用紫外-可见分光光度计测待测液的Abs。

2 结果与讨论

2.1 红外光谱分析

将烘干的KBr研磨成粉末，压片后制作成基底，再在干燥的实验环境中将样品与KBr粉末碾磨均匀（比例约为1∶100），压成半透明的薄片，在500～4 500 cm-1内进行扫描，得到槲皮素、H1和H1/槲皮素包合物的红外吸收光谱图（见图1上）。a的主要特征吸收峰出现在3 357、1 667、1 616、1 534、1 272 cm-1处，b的主要特征吸收峰出现在3 365、2 949、1 686、1 463、1 202、1 125、1 075、628 cm-1处，H1与槲皮素包合物（c）的特征吸收峰中和了以上两种物质的特征吸收峰，两种物质的吸收峰大致相同，峰的强度有所差异，原因是所处环境不同，吸收强度不同。由此证明，H1和槲皮素已经形成了包合物。同理，H2和槲皮素也形成了包合物（见图1下）。

图1 红外光谱

2.2 扫描电镜分析

从图2所示的电镜扫描图中，可清晰地观察到各物质的表面形态。其中，A为槲皮素、B为H1、C为H1/槲皮素包合物、D为H2、E为H2/槲皮素包合物。A槲皮素呈表面光滑的细长条状；B呈表面粗糙的颗粒状；C呈表面光滑的碎片状；D呈表面凹凸不平的粗糙颗粒状；E呈表面光滑细腻的块状。由此可见，无论是H1还是H2，与槲皮素包合后，表面变得更加光滑平整，这可能是槲皮素与H1或H2相互作用引起的。

图2 扫描电镜

2.3 槲皮素标准曲线分析

配制好的槲皮素乙醇溶液浓度分别为0.8×10-5、1.6×10-5、2.4×10-5、3.2×10-5、4.0×10-5、4.8×10-5、5.6×10-5mol/L，在室温下扫描槲皮素的Abs（扫描波长λ在300～500 nm），结果见图3。由图3可知，在同一波长下测得的Abs先随着槲皮素乙醇溶液浓度的增大而增大，并在376 nm附近出现最高峰，因此，取λ=376 nm处的Abs绘制标准工作曲线，曲线方程为：y=0.232 6x+0.022 3（R2=0.998 5）。

图3 槲皮素标准工作曲线

2.4 H/槲皮素的结合常数分析

客体在300～550 nm波长范围内有紫外吸收，而H1和H2在此区间几乎没有吸收，因此，选取固定的槲皮素浓度（2.0×10-5mol/L），只改变H1的浓度进行测定。在无水乙醇和水的混合溶液（V无水乙醇∶V水=3∶2）中加入H1，紫外吸收光谱和拟合线性曲线如图4所示。图4中的插图为[H]0[G]0/ΔA对[H]0绘制的拟合曲线，两者呈现良好的线性关系，表明H1与槲皮素的包合比为1∶1；随着H1的浓度不断增加，槲皮素的吸光度也不断增大，吸收峰由376 nm迁移到385 nm，发生轻微红移，可能是槲皮素与H1包合后产生p-π电子跃迁引起的[10]，由此说明H1与槲皮素形成了包合物。

图4 紫外吸收光谱和结合常数拟合曲线

H1与槲皮素的包合比例为1∶1，因此，H1与槲皮素的反应过程满足下列公式[11]：

式中：[H]0表示H1的初始浓度，[G]0表示槲皮素的初始浓度，α为紫外光谱的敏感因子，ΔA为H1的相对紫外吸收强度。用[G]0[H]0/ΔA对[H]0作图，得到如图4所示的线性拟合曲线。由图4可看出，H1与槲皮素呈现良好的线性关系。H1与槲皮素之间的结合常数KS可以由拟合曲线的斜率与截距得出。经计算得到：KS/1=3.88×105。同理可得：H2与槲皮素的结合常数KS/2=3.11×105。

2.5 包合物水溶性分析

用紫外-可见分光光度计测待测液的Abs，根据室温下客体的标准工作曲线：y=0.105 1x－0.000 1（R2=0.999 4）计算得到，客体在水中的溶解度S=0.02 mg/mL，H1与槲皮素包合物在水中的溶解度S1=1.50 mg/mL，增容了75倍左右；H2与槲皮素的包合物在水中的溶解度S2=1.12 mg/mL，增容了56倍左右。

3 结语

首先，通过饱和水溶液合成2种修饰β-CD，通过IR、UV、SEM进行表征；其次，采用紫外光谱测定了H1、H2与槲皮素的结合常数，计算出H1/H2与槲皮素之间的结合常数KS，KS/1=3.88×105，KS/2=3.11×105；最后，采用饱和水溶液法比较两种包合物的水溶性。实验证明，H1与槲皮素的包合物增容了75倍左右，H2与槲皮素的包合物增容了56倍左右。原因可能是修饰β-CD中的氨基有效提高了CD对槲皮素的包合能力。H1比H2链上多两个“N”，增加了识别位点，提高了长链对槲皮素的包合能力，所以H1的溶解度和溶解性均大于H2。