拉萨市健康人群与Hp感染者肠道菌群多样性特征*

姚芸霞 王中华

（1.西藏大学医学院；2.西藏自治区人民医院，西藏 拉萨 850000）

肠道菌群与人体的健康和疾病息息相关，肠道菌群紊乱会对人体免疫调节、消化吸收、能量代谢产生不利影响，如肠炎、肥胖症、糖尿病、慢性肾功能不全、癌症、动脉粥样硬化、高血压、血脂异常、心力衰竭及一些精神疾病等与肠道菌群及代谢产物的失调密切相关［1-7］。

我国是Hp 感染的高发国家，高原地区人群Hp 感染率比我国自然人群Hp 平均感染率(58.07%)略高［8］。高原地区Hp 高感染率可能有四个方面原因：一是与该地区人群长期居住在青藏高原高寒低氧环境中的高原习服有关；二是与高原地区藏族人群遗传背景有关；三是高原地区生活条件、经济水平和卫生条件相对较低；四是与高原地区人群饮食结构有关，如饮食单一，主要以糌粑为主，且人们喜食风干生牛羊肉、好饮酒、酥油茶、酸奶等食物［9-10］。郭春亮等对拉萨市Hp 感染人群调查表明，就诊人群Hp 感染率达到了59.4%，结果与自治区以往Hp感染流行病学调查结果相似，且藏族人群Hp 感染率(62.9%)高于汉族人群Hp感染率(57.9%)［12］。吴梦华等对长期在西藏居住的4332例Hp感染进行研究发现，Hp总感染率为61.9%，男性Hp感染率(63.7%)高于女性Hp感染率(59.9%)，同时发现西藏地区消化道相关疾病患者中，复合型溃疡Hp检测阳性率最高，高达89.4%［11］。

相关研究表明，在遗传背景确定的前提下农牧区的藏族人群肠道菌群与饮食结构相关，汉族人群进入高原后，饮食结构趋于藏族人群时，其肠道菌群结构会趋于藏族人群肠道菌群结构变化［13］。Pallav等研究发现人体肠道菌群的稳定会受到抗生素阿莫西林影响［14］。Kleessen等人的研究中，长期生活在高原地区人群，肠道菌群会因缺氧等因素的影响下显著改变，如大肠杆菌（Escherichia coli）等潜在致病菌增加，而阿托波氏菌属（Atopobium）、迟缓埃格特菌属（Escherichia）、红蝽杆菌属（Rhodobacterium）及双歧杆菌属（Bifidobacteriu）等益生菌减少［15］。Eun 等对慢性胃炎及肠上皮化生患者的肠道菌群研究发现，未感染Hp 人群与感染Hp人群肠道菌群之间有显著差异［16］。国内相关学者也对Hp 感染对肠道菌群多样性结构的影响进行了研究。董红霞等研究发现，Hp 感染会导致患者肠道菌群中乳酸杆菌、双歧杆菌等益生菌数量显著下降，使得肠道内益生菌的定植能力下降，同时大肠杆菌数量上升，大肠杆菌的感染风险也增加，PCR-DGGE 结果也显示，Hp 感染人群肠道菌群多样性和丰富度均低于Hp 阴性人群［17］。翁雅萍等研究发现，Hp 感染患者消化性溃疡时，肠道菌群多样性降低，抗Hp 治疗会进一步导致肠道菌群多样性下降，停药4 周后肠道菌群有恢复趋势［18］。高原地区人群感染Hp 后，人体肠道菌群是否会产生相应的改变还未知。

1 材料与方法

1.1 样品采集

Hp 感染组：纳 入2020 年8 月至2021 年8 月在西藏自治区人民医院住院部进行检查，经13C 呼气实验确诊为Hp 感染的患者，且近三个月未使用抗生素及PPI，对Hp感染进行粪便样本采集。

健康组：纳入2020 年8 月至2021 年8 月在西藏自治区人民医院体检中心进行13C 呼气实验，结果为阴性，近三个月未使用抗生素及PPI，无急、慢性心脏病，且肝肾功能正常，无其他消化系统等疾病，对Hp 阴性人群进行粪便样本采集。

纳入标准：年龄为≥18 岁且＜60 岁；性别：随机抽样，男女比例合适；民族：藏族；检查：初次13C 呼气实验确诊Hp感染、肝肾功能正常。

1.2 测序及分析

肠道细菌总DNA 采用SDS加酶法提取，细菌PCR扩增引物设计为：16SrDNA V3-V4 区338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)-806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。检测合格的PCR 扩增产物利用Illumina HiSeq 平台进行高通量测序（美吉）。数据利用R 软件和SPSS 软件进行分析，图片用AI进行处理。

2 研究结果

2.1 测序结果

通过高容量测序共得到280629条序列，其中健康组共149703 条，Hp 感染组共130926 条，进过抽平后每个样本的序列有142526 条，测序的平均覆盖率(Coverage)为99.91%，说明测序基本覆盖了样本中的细菌菌群，测序比较完全。通过测序得到的细菌样本序列，相比健康组，Hp 感染后，肠道细菌的数量会有所下降。Shannon多样性分析表明(如图1)，Hp感染明显低于健康组，说明Hp 感染后，肠道细菌多样性下降，肠道细菌菌群结构发生了紊乱。

2.2 肠道细菌Bata多样性统计分析

基于ANOSIM 组间差异检验的Bray-Curtis 距离算法，对健康组合Hp 感染组菌群组成进行NMDS 非度量多维尺度分析(non-metric multidimensional scaling)，结果表明，在门水平显示(如图2A)，NMDS 分析结果的优劣(Stress＜0.05)，分析结果具有很好的代表性，门水平健康组置信区间较广，菌门代表性最高，Hp感染组置信区间较窄，说明感染Hp 后，相比健康人群，肠道细菌菌门出现了下降；在属水平显示(如图2B)，NMDS 分析结果的优劣(Stress＜0.05)，分析结果是一个好的排序，属水平Hp 感染组置信区间较大，菌属种类最高，健康组置信区间较窄，说明Hp 感染之后，肠道菌群菌属发生了紊乱，细菌菌属增加。

2.3 肠道细菌结构组成

在门水平的分析结果显示(如图3)，健康组注释到的菌门包括Bacteroidota(65.86%)、Firmicutes(26.97%)、Actinobacteriota(5.45%)、Proteobacteria(1.34%)、Cyanobacteria(0.27%)、Verrucomicrobiota(0.08%)、Desulfobacterota(0.02%)，其中Bacteroidota、Firmicutes、Actinobacteriota和Proteobacteria是健康组的优势菌门。Hp 感染组注释到的菌门包括：Bacteroidota(60.79%)、Firmicutes(33.95%)、Proteobacteria(3.31%)、Cyanobacteria(1.31%)、Actinobacteriota(0.51%)、Verrucomicrobiota(0.08%)、Desulfobacterota(0.03%)、Fusobacteriota(0.01%)、Campilobacterota(0.01%)，其中Bacteroidota和Firmicutes是Hp感染组的优势菌门。在菌门水平对比显示，Hp 感染组Actinobacteriota 出现明显下降，未注释到的未知菌群有明显上升。

在菌属水平的分析结果显示(如图4)，健康组注释到的菌门包括：Prevotella(47.73%)、Bacteroides(7.67%)、Bifidobacterium(5.30%)、Prevotellaceae(5.15%)、Faecalibacterium(2.81%)、Agathobacter(3.10%)、Alloprevotella(2.48%)、Megamonas(3.88%)、Roseburia(2.76%)、Sutterella(1.09%)、Ruminococcus(1.65%)、Parabacteroides(1.13%)、Muribaculaceae(1.01%)等，健康组的主要优势菌属是Prevotella。Hp 感染组注释到的菌门包括：Prevotella(33.52%)、Faecalibacterium(11.28%)、Bacteroides(9.22%)、Rikenellaceae_RC9_gut_group(6.48%)、f_Muribaculaceae(5.33%)、Agathobacter(2.74%)、Alloprevotella(2.04%)、Roseburia(0.96%)、Sutterella(1.67%)、Streptococcus(2.34%)、Alistipes(2.07%)、f_Eubacterium_coprostanoligenes_group(2.00%)、UCG -002(1.54%)、Blautia(1.28%)、o_Gastranaerophilales(1.29%)、o_Rhodospirillales(1.43%)、UCG-003(1.20%)等，Hp感染组主要优势菌属是Prevotella和Faecalibacterium。在菌属水平，Hp感染组各个菌属平均相对丰度有不同程度降低，肠道菌群发生了紊乱。

2.4 肠道细菌差异菌群

在菌门和属水平上通过单因素方差分析(Oneway ANOVA)，对肠道菌群样本进行组间差异显著性检验分析，同时对差异菌群进行post-hoc 检验分析发现，门水平上，健康组和Hp 感染组在Campilobacterota门存在显著差异(图5A)；属水平上，健康组和Hp 感染组在Lachnoclostridium 和Senegalimassilia 存在显著差异(P＜0.05)(图5B)。

3 结论

在肠道菌群Shannon多样性指数上，Hp 感染明显低于健康组，Hp 感染后肠道细菌多样性下降，菌门水平健康组置信区间较广，Hp 感染组置信区间较窄，而在属层面结果相反，说明Hp 感染后肠道细菌菌群结构发生了紊乱；健康组优势菌门为Bacteroidota、Firmicutes、Actinobacteriota和Proteobacteria，优势菌属为Prevotella，Hp感染组的优势菌门为Bacteroidota和Firmicutes，优势菌属是Prevotella和Faecalibacterium，在菌门水平对比显示，Hp感染组Actinobacteriota出现明显下降，未注释到的未知菌群有明显上升，在菌属水平，Hp感染组各个菌属平均相对丰度有不同程度降低，肠道菌群发生了紊乱；健康组和Hp感染组在Campilobacterota菌门存在显著差异(P＜0.05)，在Lachnoclostridium属和Senegalimassi属存在显著差异(P＜0.05)。