全悬浮STHN-XF细胞的纯净性及核型分析

林鸷 赵本进 何锡忠 朱永军 彭丽英

摘  要：为了建立全悬浮STHN-XF种子细胞库，本研究将驯化成功的全悬浮STHN-XF细胞连续传代至F36代，通过纯净性和核型分析，结果显示，F1、F5、F16、F26、F36代的STHN-XF细胞均无菌、无支原体、无外源病毒，细胞染色体数目均为19对，即38条，结果表明各代STHN-XF细胞都是纯净的，且核型相同。

关键词：STHN-XF细胞;无菌检验;支原体检验;外源病毒检验;核型分析

基金项目：上海市农业委员会重点项目[沪农科攻字（2015）第1-7号];上海市农业科学院助推项目（ZT2018009）

作者简介：林鸷（1987— ），男，博士，助理研究员，主要从事猪伪狂犬病相关疫亩及致病机理研究;E-mail：linzhiplain@163.com

#共同第一作者

*通信作者：彭丽英（1968— ），推广研究员，主要从事兽用疫苗研究;E-mail：pengliying2010@ aliyun.com

悬浮培养细胞在国际上发展较快，已趋向成熟，是生物制品生产中应用较普遍的一种生产工艺模式。与转瓶培养细胞相比，该工艺具有操作简单、省时、成本低等优点。根据前期对猪伪狂犬病病毒株的细胞适应性的研究结果，用猪源传代细胞系——猪睾丸细胞（swine testis cell，ST细胞）繁殖猪伪狂犬病病毒株来制备疫苗效果最佳。本文对ST细胞进行悬浮培养驯化、传代，并对全悬浮STHN-XF细胞的F1、F5、F26、F36代进行纯净性和核型分析。

1  试验材料

1.1 全悬浮STHN-XF细胞

全悬浮STHN-XF细胞为上海市农业科学院畜牧兽医研究所课题组自行驯化和传代的悬浮细胞株。

1.2 培养基

培养细胞用的VirusPro ST-S细胞无血清培养基购自上海源培生物科技股份有限公司。无菌检验用的硫乙醇盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基均购自中海生物技术有限公司。支原体检验用的液体培养基和固体培养基均购自中海生物技术有限公司。

1.3 荧光抗体检测试剂盒

牛病毒性腹泻病毒、猪圆环病毒2型及猪瘟病毒的间接荧光检测试剂盒购自中海生物技术有限公司。

1.4 细胞核型分析试剂

秋水仙碱、0.075 M氯化钾溶液、Carnoy固定液[V（甲醇）∶V（冰醋酸）=3∶1]，现用现配。

1.5 其他

其他化学试剂、液氮罐、低温冰箱、   37 ℃的CO2培养箱、25 ℃的CO2培养箱、摇床、生物反应器及其他仪器设备由上海市农业科学院畜牧兽医研究所提供。

2  试验方法

2.1 细胞传代

将悬浮驯化好的STHN-XF细胞37 ℃悬浮培养48 h，细胞密度达到3×106个/mL以上进行传代，连续传代至F36代，其中将F7～F16代细胞作为生产细胞进行冻存。细胞冻存液成分为：新生牛血清20%、二甲基亚砜（DMSO）10%、最低必需（MEM）培养基70%。冻存程序为4 ℃ 30 min，-20 ℃  1 h，-70 ℃ 8 h（或过夜），将F0和F1代作为原始细胞于液氮中保存。

2.2 样本准备

分别随机取F1、F5、F16、F26、F36代细胞各3瓶，将同一代细胞充分混合、培养后，将其作为待检样本分别进行无菌、支原体及外源病毒检验。

2.3 纯净性检验

无菌检验、支原体检验、外源病毒检验均按现行2015《中华人民共和国兽药典》进行[1]。

2.3.1 无菌检验

分别将0.2 mL F1、F5、F16、F26、F36代细胞的待检样本移植到2支硫乙醇盐流体培养基管中，1支置37 ℃培养，1支置25 ℃培养;另分别取0.2 mL各代细胞移植到1支胰酪大豆胨液体培养基管，置25 ℃培养。培养7 d后，观察硫乙醇盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基的颜色是否变黄或变浑浊。

2.3.2 支原体检验

分别将5 mL F1、F5、F16、F26、F36代细胞的待检样本移植到装有20 mL液体培养基的小瓶中，搖匀后从中取0.4 mL移植到含1.8 mL培养基的2支小管中，每支0.2 mL，将小管和小瓶置37 ℃培养，分别于移植后  5 d、10 d、15 d从小瓶中取0.2 mL培养物到小管中，每日观察培养物颜色有无变黄或变红。如果无变化，在最后一次移植到小管中培养14 d后停止观察。如果发现小瓶或任何一支小管培养物颜色出现明显变化，应立即将小瓶中的培养物移植到小管液体培养基和固体培养基中，观察液体培养基是否出现恒定的pH变化，及固体培养基上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落。

2.3.3 外源病毒检验

分别将1 mL F1、F5、F26、F36代细胞的待检样本移植到3瓶单层Vero细胞和ST细胞（总面积不少于100 cm2），培养7 d，连传2代，用吉姆萨染色液对单层细胞进行常规染色，观察是否出现包涵体、巨细胞或其他外源病毒所致的细胞病变。

接种各代次细胞时加入适量0.2%豚鼠红细胞和鸡红细胞的等体积混合液，分别在    2 ℃～8 ℃和20 ℃～25 ℃条件下观察红细胞吸附现象。

按照间接荧光检测试剂盒说明书，检验各代次细胞是否感染牛病毒性腹泻病毒、猪圆环病毒2型及猪瘟病毒。

2.4 细胞核型分析

2.4.1 收获细胞

取分裂旺盛期的F1、F5、F26、F36代的STHN-XF细胞，用新鲜的培养液调整细胞浓度为2×106个/mL～4×106个/mL，加入秋水仙碱，使其质量浓度为0.05 μg/mL，置   37 ℃培养箱中处理2 h～3 h，即可收获细胞。

2.4.2 低渗处理

取出用秋水仙碱处理后的细胞，用吸管轻轻吹打混匀，移入10 mL离心管中，        1 200 r/min离心10 min，去掉上清液，加入10 mL 0.075 M氯化钾溶液，用吸管轻轻吹打混匀，置37 ℃培养箱中低渗处理30 min。

2.4.3 預固定

取出离心管，加入Carnoy固定液1 mL，用吸管轻轻吹打混匀，1 200 r/min离心10 min。

2.4.4 固定

取出离心管，去掉上清液。沿管壁缓慢加入Carnoy固定液1 mL，用吸管轻轻吹打混匀，室温固定30 min，1 200 r/min离心      10 min。连续固定3次。

2.4.5 制片

取出离心管，去掉上清液。用少量新鲜的固定液制成细胞悬液，常规法制片;70 ℃烤片2 h～3 h;标本片用0.25%吉姆萨染色液染色10 min。

2.4.6 核型分析

F1、F5、F26、F36代的STHN-XF细胞在显微镜下计数分析30～50个中期分裂相。

3  结果

3.1 细胞库的建立

将STHN-XF细胞连续传代至F36代，其中F0～F16代细胞每代冻存50管于液氮中，F26和F36代各冻存10管于液氮中。每管上标记细胞名称、冻存代次及时间。

3.2 无菌检验结果

结果发现，F1、F5、F16、F26、F36代细胞不管是在37 ℃，还是在25 ℃下培养7 d，硫乙醇盐流体培养基的颜色均未变黄和变浑浊;在25 ℃下培养7 d，胰酪大豆胨液体培养基的颜色也未变黄或变浑浊。结果表明，各代次细胞均无细菌感染。结果见表1。

3.3 支原体检验结果

结果发现，阴性对照液体培养基的颜色没有变化，移植到固体培养基后没有出现典型的“煎蛋”状菌落;阳性对照液体培养基的颜色变黄，在每次移植到固体培养基后的第7天出现典型的“煎蛋”状菌落;F1、F5、F16、F26、F36代细胞移植到液体培养基后颜色均没有变化，移植到固体培养基后均未出现典型的“煎蛋”状菌落。结果表明，各代次细胞均无支原体感染。结果见表2。

3.4 外源病毒的检验结果

3.4.1 致细胞病变检验结果

结果发现，阴性对照未出现包涵体、巨细胞或其他外源病毒所致的细胞病变，阳性对照出现了典型的细胞病变，F1、F5、F16、F26、F36代细胞均未出现细胞病变。结果表明各代次细胞均未感染外源病毒。

3.4.2 红细胞吸附检验结果

结果发现，不管在2 ℃～8 ℃，还是  20 ℃～25 ℃条件下，各代次细胞均未发现有红细胞吸附现象，结果见表3。

3.4.3 荧光抗体检测结果

对F1、F5、F26、F36代细胞进行牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的免疫荧光抗体检测后，结果未发现荧光，表明各代次细胞均未感染上述3种病毒。结果见表4。

3.5 核型分析

对F1、F5、F26、F36代细胞的染色体进行计数发现，各代细胞的染色体数目均为38条。详见图1。

4  结论

F1、F5、F16、F26、F36代的悬浮STHN-XF细胞经无菌检验、支原体检验、外源病毒检验发现，各代次的STHN-XF细胞均无菌，无支原体，无外源病毒，表明各代次STHN-XF细胞都是纯净的。

通过对STHN-XF细胞的F1、F5、F26、F36代核型分析，结果表明细胞染色体数目均为19对，即38条，且核型相同。

悬浮培养指的是非贴壁依赖性细胞的培养，细胞悬浮于培养基中生长或维持。悬浮培养可以降低生产成本，提高生产效率，便于扩大生产规模[2]。国内生物制品行业应快速实现行业升级，早日实现新技术的引进、消化和吸收，并进一步创新，早日与国际接轨，提高我国生物制品行业在国际上的竞争力[3]。

参考文献

[1] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典（2015版）[S].北京：中国农业出版社，2016.

[2] 刘鑫莹，李建华，李睿.ST单细胞悬浮生长的驯化及培养工艺优化[J].农家参谋，2018（19）：233.

[3] 陈文庆，王建超，刘华杰.悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的比较分析[J].中国兽药杂志，2010，44（10）：37-41.