石莼聚糖(绿藻门)可通过TLR4激活PI3K/Akt信号通路，诱导肠道细胞因子的产生

张涛译

摘  要：作为有益于人类和动物健康的生物活性分子，许多研究探讨了绿藻所含水溶性硫酸多糖（石莼聚糖）的生物活性。利用从法国布列塔尼（Brittany）收获的石莼绿藻（ulva armoricana）制备了纯化的绿藻，并利用猪肠道上皮细胞的体外模型（in vitro system of porcine intestinal epithelial cells，IPEC-1）测试了其刺激肠道免疫反应的能力。RT-qPCR和ELISA分析显示，纯化的绿藻可以明显增加趋化因子配体20 （CCL20）、IL8和TNF-α等细胞因子的mRNA和蛋白质的表达。利用人胚肾（human embryonic kidney，HEK）293报告细胞系的模式识别受体发现，石莼聚糖主要刺激Toll样受体（Toll-like receptors，TLR），如TLR4。该试验还研究了石莼聚糖馏分对参与激活细胞因子基因表达的不同信号通路的影响。对用石莼聚糖处理过的HEK293-TLR4细胞进行的免疫印迹表明，Akt和核因子-κB的p65亚单位的磷酸化作用增强。用特异性抑制剂抑制Akt的磷酸化，可以消除石莼聚糖介导的增加IL-8分泌的作用。总体结果表明，石莼聚糖本身是一种免疫刺激化合物，此外，在疫苗接种策略中，它可以有效复合Toll样受体配体并将其传递给相关免疫细胞。

关键词：藻类;石莼聚糖;肠道上皮细胞;免疫刺激;细胞因子

源自海洋藻类植物的化合物具有各种生物活性，它们可应用于食品、化妆品和制药业以及微生物学和生物技术。海洋藻类植物产生的生物活性代谢物主要是肽、多不饱和脂肪酸、色素、多酚和多糖。高度合成的硫酸多糖普遍存在于绿藻、褐藻和红藻三种主要海洋藻类植物的细胞壁基质中，占干重的4%～76%。从绿藻、褐藻和红藻中提取的硫酸多糖分别被称为石莼聚糖、墨角藻聚糖和角叉菜多糖（carrageenans）。来自绿藻的石莼聚糖，如硬石莼（ulva rigida）和浒苔（Enteromorpha sp.）主要由硫酸鼠李糖残基和尿酸组成，形成一个被称为双己糖醛酸的重复二糖单位β-D-葡萄糖醛酸-（1，4）-α-L-鼠李糖3-硫酸盐。体外和体内研究表明，石莼聚糖——类似于脱氧半乳聚糖和角叉菜多糖，具有广泛的生物活性，如抗凝血、抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗增殖和免疫调节。详细筛选表明，低分子量的石莼聚糖与免疫细胞的相互作用会使细胞和分子产生一系列活动，激活免疫系统控或制炎症反应过程。最近的研究表明，石莼聚糖能够增强吞噬作用和其他巨噬细胞的功能，如活性氧（reactive oxygen species，ROS）和一氧化氮（NO）的产生，以及促炎症细胞因子的分泌，如肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor，TNF-α）、白细胞介素-1（interleukins，IL-1）、IL-6、IL-8、IL-12和干扰素（interferon，IFN）。此外，相关研究人员利用被脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）激活的巨噬细胞系探讨了石莼聚糖的抗炎作用，结果发现LPS引发的促炎细胞因子（包括IL-1β、IL-6和TNF-α）的分泌和NO的产生明显减少。这些数据表明，低分子量的石莼聚糖具有免疫调节活性，但石莼聚糖调节免疫反应的潜在分子机制尚未得到明确的阐明。然而，像那些来自植物、真菌或酵母的多糖一样，来自海洋藻类植物的角叉菜多糖和褐藻多糖能够通过与靶细胞上表达的Toll样受体（如Toll-like receptors-4，TLR4）结合，诱导信号通路，激活转录因子NF-κB，直接调节先天免疫反应。

例如，红藻的λ-角叉菜多糖以TLR4依赖的方式刺激小鼠T细胞培养，产生一个T辅助1（T helper 1，Th1）模式的细胞因子反应。然而，用缺乏TLR4的小鼠制备的脾细胞仍然保留了能对λ-角叉菜多糖产生γ-干扰素的部分能力，这表明模式识别受体（pattern recognition receptors，PRR）而非TLR4参与了此生理活动。角叉菜多糖也被用作佐剂，并可以通过TLR4途径在接种人乳头瘤病毒E7肽的小鼠中产生高抗原特异性的免疫反应。褐藻的墨角藻聚糖可以通过膜受体TLR4、CD14和A族清道夫受体（scavenger receptor class-A，SR-A）以及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号途径诱导巨噬细胞活化。墨角藻聚糖还可以通过一个有转录因子NF-κB参与的途径对骨髓衍生树突状细胞产生免疫刺激和成熟的作用。然而，参与的受体尚未被确定。

有关从法国海岸收获的海洋藻类植物中提取的藻类多糖对动物免疫反应调节潜力的研究很少。最近，我们首次评估了用从2012年在法国布列塔尼北部海岸收获的绿色大型海藻石莼绿藻制备的海藻硫酸多糖（marine sulfated polysaccharides，MSPs）提取物的抗菌和免疫刺激活性。结果发现，这种海藻硫酸多糖MSP提取物能够抑制致病菌的生长，并通过利用猪肠道上皮细胞系的体外模型（in vitro system of porcine intestinal epithelial cells，IPEC-1）能夠刺激免疫反应介质如IL1α、IL1β、IL-6、IL-8、TNF-α、转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF β）和趋化因子配体20（CC chemokine ligand 20，CCL20）的mRNA表达。

在本研究中，利用2013年在同一地区收获的海藻制备了一批新的海藻硫酸多糖MSPs，并用于纯化低分子量的石莼聚糖馏分。该试验首先试图评估这种石莼聚糖馏分与海藻硫酸多糖MSPs提取物相比的免疫刺激活性，其次试图阐明这种生物活性的潜在分子机制。因此，我们使用IPEC-1体外模型研究了这种石莼聚糖发馏物是否能够刺激细胞因子的表达，并评估了它与表达特征识别受体（pattern recognition receptor，PRRs）的人胚肾细胞293（human embryo kidney cell 293，HEK293）细胞系的相互作用，以确定目标受体。我们还对TLR刺激后参与细胞因子表达的信号通路进行了鉴定。了解石莼聚糖介导的免疫刺激活性的机制对于设计生物活性多糖作为未来预防/治疗策略的健康改善分子以增强宿主的免疫反应非常重要。

1  结果

1.1 石莼聚糖馏分的组成

提取物和纯化后的石莼聚糖馏分的化学成分利用元素和近似值分析、单体糖分析和分子量来确定。表2显示，纯化步骤除去了所有的盐分和矿物质，灰分含量从32.9%降至2.9%。近似值分析显示，纯化步骤将有机物含量提高到92.5%，主要由碳水化合物和蛋白质组成。分析海藻硫酸多糖MSPs提取物中糖的组成毫无意义，且该结果无法使用，检测到的糖类含量低，标准误差高，这与该方法在盐类含量高时的低可复制性有关。经过旨在去除样本中盐分的超滤步骤，推断出有机物的含量为89.6%，其中72.4%是碳水化合物，主要是中性糖和尿酸。经计算发现，石莼聚糖馏分的产量为20.5%。

糖类残留物的组成以低标准偏差的方法进行了测定，占干重的70.9%，略低于用近似值分析所测得的结果。推断出的石莼聚糖馏分的最终组成为39.55%的鼠李糖、32.2%的尿酸、24.4%的葡萄糖醛酸、2.75%的木糖和8.3%的硫酸盐。加权平均（Mw）和数量平均（Mn）的分子量分别为3.2×103 Da和2.9×103 Da，多分散性指数为1.1。

1.2 石莼绿藻能够在IPEC-1细胞中刺激IL-8、TNF-α和CCL20的mRNA表达

在研究两种提取物的刺激作用之前，通过用浓度不断增加的海藻硫酸多糖MSPs提取物（图1A）和石莼聚糖（图1B）培育IPEC-1细胞以检测细胞毒性，并使用台朌蓝排除试验（trypan blue exclusion test）测定细胞的活力。当质量浓度为0.5 mg/mL时，没有发现有明显的细胞毒性，细胞的增殖也未受到影响。因此，将已分化的IPEC-1细胞置于500 μg/mL、50 μg/mL和5 μg/mL的质量浓度下4 h后，首先在mRNA水平上研究了石莼聚糖馏分刺激细胞因子表达的能力，并与海藻硫酸多糖MSPs提取物进行比较。mRNA的相对量化——以倍数变化表示——表明，500 μg/mL的海藻硫酸多糖MSPs提取物能够显著提高CCL20（×74.9）、IL-8（×85.4）和TNF-α（×29.9）的相对表达量（P<0.01）。纯化步骤并不会影响石莼聚糖的生物活性，而且仍能保持其在IPEC-1细胞中激活细胞因子表达的作用。事实上，mRNA表达分析显示，纯化的石莼聚糖馏分可以提高CCL20（×61.5）、IL-8（×79.7）和TNF-α（×36.4）的表达，提高的幅度与海藻硫酸多糖MSPs提取物的相似（图2A和2B）。

1.3 石莼绿藻诱导已分化的IPEC-1细胞分泌IL-8和TNF-α蛋白

在研究证明已分化的IPEC-1细胞能够在mRNA水平上对纯化的石莼聚糖馏分作出反应后，我们试图利用ELISA方法来证实和扩展这一结果。将IPEC-1细胞在转孔过滤器上培养，并通过加入质量浓度为500 μg/mL的石莼聚糖刺激过夜，分别分析顶层和基底层的上清液。如图3所示，石莼聚糖馏分能够刺激IL-8和TNF-α蛋白分泌到收集的上清液中，但因所收集上清液的来源层不同，会有不同的水平。与未处理的对照组相比，在顶层（5 446 pg/mL±    308 pg/mL）和基底层（1 980 pg/mL±    190 pg/mL）都能检测到IL-8的数量明显增加（P<0.01）（图3）。石莼聚糖处理也可以刺激IPEC-1细胞在这两个来源层中释放TNF-α，但其水平远低于IL-8的（125.5 pg/mL±                            18.5 pg/mL与5 446 pg/mL±308 pg/mL相比，7.8 pg/mL±1.2 pg/mL与1 980 pg/mL± 190 pg/mL）。下面的实验只评估石莼聚糖馏分。

1.4 石莼聚糖诱导IL-8蛋白在HEK293-TLR4細胞中的表达

为了确定参与的受体，在稳定表达受体TLR4、TLR5、TLR9、核苷酸结合寡聚结构域1（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD1）和NOD2的人胚肾（human embryonic kidney，HEK）细胞293细胞系中以500 μg/mL的质量浓度测试石莼聚糖馏分。通过用ELISA方法监测IL-8在上清液中的释放水平，评估了石莼聚糖/受体的相互作用。结果显示，与HEK293无效细胞相比，纯化的石莼聚糖馏分能够激活TLR4，在HEK293/TLR4-MD-2-CD14细胞系中诱导上调IL-8的产生。该馏分不会明显激活其余的任何受体。

1.5 石莼聚糖与TLR4的相互作用能够介导磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K）/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Serine/Threonine-Protein Kinase，Akt）和NF-κB信号通路的激活

我们接下来研究了纯化的石莼聚糖馏分对激活参与细胞因子基因表达的不同蛋白激酶的影响。因此，用石莼聚糖（500 μg/mL）对HEK293-TLR4细胞进行不同时长（5 min、  10 min、30 min和60 min）的孵育，并使用磷酸化特异性抗体来评估MAPKs（ERK1/2和p38）、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）和NF-κB的磷酸化状态。免疫印迹结果和磷酸化pAkt（phospho-AKT，pAkt）/Akt的动力学曲线分析显示，在HEK293细胞中，石莼聚糖馏分与TLR4的相互作用明显增加了Akt的磷酸化，与未处理的细胞相比，经过5 min孵育后可以检测到，与LPS处理的细胞相似。MAPKs（Erk1/2和p38）和AMP-激活激酶的磷酸化状态分析发现这些信号通路的激活在不同处理之间没有任何差异（数据未显示）。Akt通过诱导κB抑制剂（IκB）的磷酸化和随后的降解调节核因子-κB（nuclear factor，NF-κB）的转录活性。因此，我们分析了p65在HEK293-TLR4细胞中的磷酸化状态，发现石莼聚糖馏分明显增加了磷酸化p65的水平。

1.6 使用抑制剂LY294002抑制PI3K/Akt信号通路

我们首先检查了药理学抑制剂LY294002（译者注：一种PI3K抑制剂）对HEK293-TLR4细胞的增殖是否有细胞毒性作用。用LY294002或二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）处理细胞，经过16 h的孵育，与单独的DMEM相比没有影响细胞的活力。随后，用抑制剂LY294002来验证PI3K/Akt信号通路的参与。该抑制剂在终浓度为 50 μM的情况下使用16 h，能够阻断这一信号通路，并诱导IL-8的分泌减少65%以上。在用LPS处理的细胞中也得到了类似的结果，而LY294002并不影响未处理细胞中IL-8的分泌。

2  讨论

近年来，绿藻已成为天然生物活性化合物的丰富和重要来源，可用作新一代动物生长促进剂和抗生素的天然替代品，增强机体的免疫功能，减少农场动物的感染，从而改善动物的健康水平。然而，有关绿藻所含的生物活性成分及其作用机制和在动物体内的生物效应还需要进一步的研究，以最终将这些发现应用于畜牧生产。在这种情况下，我们最近利用绿色大型海藻石莼绿藻制备了一种海藻硫酸多糖（marine sulfated polysaccharides）提取物，并利用猪肠道上皮细胞系IPEC-1的体外模型进行了研究，显示其能够刺激一系列的细胞因子和趋化因子的mRNA表达。化学成分分析表明，该提取物的主要成分是石莼聚糖，并且这一成分被认为是免疫刺激活性的主要候选成分，不过需要对样本做进一步的纯化以最终确认。在本研究中，我们利用2013年夏天在同一地区收获的海藻制备了一批新的海藻硫酸多糖，通过纯化后获得了石莼聚糖馏分，以评估其与海藻硫酸多糖提取物相比的免疫调节潜力。对这批新的海藻硫酸多糖进行成分分析后发现，其与之前制备和测试的海藻硫酸多糖提取物含有相似的成分。纯化过程使我们获得了有机物含量高的石莼聚糖馏分（高达89.6%），其中72.4%是碳水化合物，主要为中性糖和尿酸。推断出的石莼聚糖馏分的最终成分是39.6%的鼠李糖、32.2%的尿酸、24.4%的葡萄糖醛酸、2.8%的木糖、8.3%的硫酸盐和8.9%的蛋白质，这些成分代表了绿藻石莼聚糖中典型的主要成分。此外，元素分析也显示其含有蛋白质，这与之前描述的硫酸多糖与绿藻细胞壁结构中的蛋白质密切相关的事实一致。

用这批新的海藻硫酸多糖以及纯化的石莼聚糖馏分处理已分化的IPEC-1细胞，可诱导CCL20、TNF-α和IL-8 mRNA表达的上调。此外，利用ELISA方法分析发现，纯化的石莼聚糖馏分能够刺激细胞因子在基底层和顶层上清液中的分泌。这些结果与之前获得的相似，表明该提取过程适合于制备含有可重现的分析成分和免疫刺激活性的海藻硫酸多糖MSPs提取物。此外，纯化步骤对提高该免疫刺激活性特别有用，这可能归功于石莼聚糖馏分。海藻硫酸多糖提取物以及石莼聚糖馏分能够刺激猪产生肠道细胞因子，不能归因于内毒素污染，因为用E-Toxate试剂盒分析发现，该提取物的分馏多糖不含内毒素化合物（数据未显示）。这项研究对确定最佳的提取处理工艺具有实际意义，以生产出具有有效免疫刺激活性的天然生物活性分子，用于畜禽日粮，改善动物的免疫反应，从而提高它们对传染病的抵抗力。

评估藻类多糖免疫学特性的许多研究主要使用巨噬细胞系，如小鼠RAW264.7，很少用猪肠道上皮细胞进行测试。与褐藻聚糖硫酸酯（funcoidan）和角叉菜多糖类一样，石莼聚糖直接在巨噬细胞系上进行测试，或在用LPS挑战之后，分别测试其免疫刺激反应或抗炎反应。虽然巨噬细胞是动物先天免疫的重要效应细胞，但肠道上皮细胞也令人感兴趣，因为它们表达了模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs），使它们能够作为微生物环境和外来抗原的动态传感器。因此，我们在研究中使用的已分化的IPEC-1细胞是一个相关且合适的体外模型，将允许测试和评估日粮中生物活性化合物，如海藻硫酸多糖刺激肠道免疫反应的效果。很明显，肠道上皮细胞是肠道平衡的关键媒介，通过产生大量参与邻近免疫细胞激活、运输和功能的细胞因子，加强屏障功能，并参与协调合理的黏膜免疫反应。由于它们能够识别特定的碳水化合物分子，并引起免疫反应，我们假设PRRs，更具体地说是TLRs和NODs，被石莼聚糖馏分激活，通过信号级联系统，刺激产生细胞因子。因此，我们使用HEK2P3细胞模型来检测大量的TLR和NOD受体，结果显示石莼聚糖馏分能够激活HEK2P3细胞的免疫信号，表达TLR4。这意味着石莼聚糖可以通过TLR4直接作用于靶细胞，包括肠道细胞或免疫细胞，并会不同程度地影響免疫学指标的表达。我们还分析了信号通路的激活，表明石莼聚糖与TLR4的相互作用可以介导PI3K/Akt信号通路的激活，该通路可调节NF-κB的转录活性。使用特异性药理学抑制剂LY294002证实了PI3K/Akt途径的参与。在以前的报道中，正常的人结肠上皮细胞系NCM460暴露于从红藻中净化的硫酸多聚半乳糖角叉菜多糖（carrageenan，CGN），显示能够刺激产生IL-8。与我们的研究类似，这种CGN能够识别TLR4受体，并诱导B细胞淋巴瘤-NFκB的激活，从而介导细胞因子的产生。

据报道，PI3K/Akt通路的激活与不同细胞中的TLR2、TLR3、TLR4和TLR5有关，并在TLR信号通路上发挥促炎症和抗炎症的作用。因此，这种石莼聚糖馏分可能发挥双重作用，表现出免疫调节活性，可能在刺激免疫反应或控制炎症方面具有潜在的应用价值，正如来自其他海藻的多糖提取物所报道的那样。

3  总结

总的来说，这些体外试验结果为海藻硫酸多糖用来刺激可溶性细胞因子和趋化因子产生的分子机制提供了新的见解，并表明这种信号传导可以在与TLR4相互作用后实现，诱导PI3K/Akt和NF-κB途径的激活。尽管这些体外研究结果有助于解释石莼聚糖用来刺激细胞因子表达的分子机制，但我们不能排除通过一种可能在肠道表面更复杂的机制参与下的其他受体和替代信号通路。天然的TLR配体（TLR ligands，TLRLs）及其类似物正越来越多地被应用于免疫治疗策略。由于TLRLs是先天免疫反应的强有力的诱导剂，它们已被用作佐剂来刺激适应性免疫反应。制药工业将自然衍生聚合物（naturally derived polymers）作为药物释放应用中的多功能材料，这已成为人们日益关注的主题，推动了相关行业不断开发此类化合物。海藻硫酸多糖最近已被制作成纳米粒子和微粒子，这主要是由于它们的离子性质。因此，TLR的配体可以被封装入可生物降解的石莼聚糖纳米颗粒中，以便在疫苗接种策略中能够被传递给相关的免疫靶细胞。然而，还需要使用体内模型和体外模型进行进一步的研究，以确定在生理条件下和感染或炎症过程中海藻硫酸多糖对免疫反应的刺激作用。

原题名：Ulvan from Ulva armoricana （Chlorophyta） activates the PI3K/Akt signalling pathway via TLR4 to induce intestinal cytokine production（英文）

原作者：Mustapha Berria、Michel Oliviera和 Sébastien Holberta等