VU0360172激活mGluR5对新生大鼠生发基质出血的保护作用

王筱雅，冯占辉，熊 英，张 晴，杨 清，陈惠心，汪朝云，左 丁，叶 兰

(1.贵州医科大学 1.基础医学院药理学教研室、2.附属医院神经内科、3.基础医学院机能学实验室，贵州 贵阳 550025)

生发基质出血(germinal matrix hemorrhage，GMH)是发生于早产儿的一类严重脑出血疾病，其出血位置源自侧脑室下方室管膜区域的生发基质层，这里是婴幼儿重要的神经发生部位，其中富含脆弱的血管。因未成熟的大脑缺乏自我调节功能，故早产儿脑部血流产生波动便极易造成血管破裂，从而发生出血[1]。GMH在早产儿及低体重出生儿中的发病率和死亡率极高，并伴有脑瘫、癫痫、发育迟缓等神经系统后遗症[2]，严重危害早产儿的生命与健康。目前临床上仍然缺乏有效的治疗药物，故探索新型治疗靶点具有重要的医学意义。

代谢型谷氨酸受体5(metabotropic glutamate receptor 5，mGluR5)是一种G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor，GPCR)，在神经元细胞膜上有表达，在神经网络调节中起重要作用[3]，参与突触可塑性和痛觉调节[4]。有研究发现，激动mGluR5在创伤性脑损伤[5]、蛛网膜下腔出血[6]、成人脑出血[7]、脑缺血[8]等神经系统疾病模型中发挥出较良好的疗效，有抗神经元凋亡、增强神经发生、改善神经功能的作用，但在GMH模型中的作用尚未有研究报道。VU0360172是一种新型的mGluR5正向变构调节剂，具有特异性好、口服利用率高、可透过血脑屏障等特点[9]，有研究表明，用VU0360172激动mGluR5可有效改善癫痫[10]和蛛网膜下腔出血引起的神经功能损伤。本文探讨了利用VU0360172激动mGluR5对生发基质出血产生的保护作用，并初步探究其产生保护作用的机制可能与抗神经元凋亡有关。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1动物 新生7日龄SD大鼠129只，♀♂各半，体质量(13～16) g，SPF级，购于贵州医科大学实验动物中心，生产许可证SCXK(辽)2020-0001。使用许可证SYXK(黔)2018-0001。

1.1.2主要材料与试剂 异氟烷：深圳瑞沃德生命科技有限公司；Ⅶ-S型胶原酶(批号：128M4107V)：美国Sigma公司；TESCA缓冲液(pH 7.4，批号：20191114)：索莱宝公司；VU0360172(批号：0586901-1)：Cayman公司；都氏试剂：上海羽朵生物科技有限公司；多聚甲醛固定液、SWE快速高分辨电泳缓冲液、转膜缓冲液粉末、抗β-actin抗体(批号：Ls202319)：武汉赛维尔生物科技有限公司；预染蛋白质分子量标准(批号：00864849)：Thermo Fisher公司；氟化聚偏乙烯PVDF微孔转移膜(批号：R0BB23468)：Millipore公司；高效封闭液：Genefist公司；抗mGluR5(批号：34r8599)、cleaved-caspase-3(批号：15z0096)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体(批号：56j9958)、ECL发光液(批号：1824c03)：艾菲公司；抗Bcl-2抗体(批号：I07161556)：万类公司。

1.1.3仪器 小动物麻醉机、脑立体定位仪(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；天平(METTLER TOLEDO公司)；电热鼓风干燥箱(上海博迅实业)；酶标仪(BioTek公司)；高速冷冻离心机(Eppendorf公司)；正置光学显微镜(日本尼康)；电泳转膜仪(北京六一仪器厂)；凝胶成像系统(Bio-Rad公司)。

1.2 试验方法

1.2.1造模 新生7日龄SD大鼠称重编号，诱导麻醉后固定于脑立体定位仪上，切开头皮暴露前囟，以前囟为原点，坐标1.6 mm(前)和1.5 mm(右)处钻一1 mm小洞，用微量进样针插入硬脑膜下2.7 mm(深)处，以1 μL·min-1速度注射胶原酶共0.3 U，留针5 min防止泄露。拔针后用骨蜡封住颅骨小洞，缝合头皮。术后放置于37 ℃环境中恢复苏醒，然后放回母鼠身边。假手术组仅进行脑部进针，不注射胶原酶。

1.2.2实验分组 实验共分为5组：假手术组(Sham组)；模型组(GMH组)；VU0360172低、中、高剂量组(0.75 mg·kg-1、1.5 mg·kg-1、3.0 mg·kg-1)。每组21只大鼠。

1.2.3给药 造模后3 h，VU0360172按低、中、高剂量给药(i.p.)，假手术和模型组给予等容积的溶剂(0.02 DMSO+0.1吐温80+0.2 PEG400+生理盐水)。

1.2.4短期行为学测试 造模后24 h进行，每组6只大鼠，测试完成继续进行后续实验。

1.2.4.1 翻正反射 用手将乳鼠仰面固定于台面上，松手后记录其由仰卧姿势完全翻正为四足站立所需的时间。

1.2.4.2 负趋地性 将乳鼠头朝向下方，置于一呈45°倾斜角的粗糙斜面上，记录乳鼠倒转180°所需的时间。

1.2.4.3 神经功能缺陷评分 采用Longa评分[11]，评分标准：0分，正常行走；1分，左侧前肢伸展不完全；2分，行走过程向对侧转圈；3分，行走过程中跌倒；4分，意识丧失，无自主行为。

1.2.5脑含水量测定 造模后24 h断头取脑，称取脑组织湿重，100 ℃烘干24 h称取干重。脑组织含水量/%=(脑组织湿重-脑组织干重)/脑组织湿重×100%。每组6只。

1.2.6血红蛋白测定 造模后24 h将乳鼠麻醉，PBS心脏灌流后断头取脑，称取右侧半球置于EP管中，加入2 mL PBS，冰上超声1 min，4 ℃ 13 000 r·min-1离心20 min，取上清液20 μL，按1 ∶4比例加入都氏试剂，室温下充分静置15 min，酶标仪540 nm处比色。每组6只。

1.2.7HE染色 造模后24 h乳鼠麻醉，断头取脑，迅速放入多聚甲醛固定液进行固定，石蜡包埋切片，进行苏木精-伊红染色，显微镜镜检乳鼠脑组织病理学变化。每组3只。

1.2.8Western blot检测 Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白的表达 造模后24 h心脏灌流取脑。180 mA转膜，快速封闭液室温封闭10 min，加入抗Bcl-2、cleaved-caspase-3抗体，4 ℃孵育过夜。每组6只。

2 结果

2.1 VU0360172对GMH乳鼠神经功能的影响与假手术组相比，模型组在翻正反射和负趋地性实验中所消耗时间增长，神经行为学评分升高(P<0.01)。与模型组相比，VU0360172给药高剂量组明显缩短乳鼠神经行为学测试所需时间，神经功能缺陷评分降低，结果差异具有显著性(P<0.05)(Fig 1)。

Fig 1 Effect of VU0360172 on neurobehavioral S: Sham; G: GMH; L: VU0360172 0.75 mg·kg-1; M: VU0360172 1.5 mg·kg-1; H: VU0360172 3.0 mg·kg-1. Respective time taking for body righting test and negative geotaxis test and neurological scores estimated 24 h after GMH. **P<0.01 vs Sham; #P<0.05， ##P<0.01 vs GMH.

2.2 VU0360172对GMH乳鼠脑含水量和脑血红蛋白含量的影响与假手术组相比，模型组乳鼠脑含水量和脑血红蛋白含量显著增加(P<0.01)。与模型组相比，VU0360172给药高剂量组乳鼠脑含水量和血红蛋白含量降低，结果差异具有显著性(P<0.05)(Fig 2)。

Fig 2 Effect of VU0360172 ameliorating outcomes of GMH in n=6)S: Sham; G: GMH; L: VU0360172 0.75 mg·kg-1; M: VU0360172 1.5 mg·kg-1; H: VU0360172 3.0 mg·kg-1. A: Brain water content. B: Quantification of brain blood volume 24 h after GMH. **P<0.01 vs sham; #P<0.05，##P<0.01 vs GMH.

2.3 VU0360172对GMH乳鼠脑组织病理形态学的影响HE染色结果表明，与假手术组相比，模型组患侧侧脑室显著增宽，基底节区结构破坏，基底节区和脑室下区(subventricular zone, SVZ)可见广泛红细胞和炎性细胞浸润。VU0360172低剂量组与模型组比较无明显差别。中剂量组侧脑室中度扩大，基底节区结构轻度破坏，SVZ区炎性细胞浸润明显。高剂量组侧脑室轻度扩大，基底节区有少量红细胞浸润，SVZ区可见红细胞和炎性细胞浸润，但面积较中剂量组明显减少，病理损伤明显改善(Fig 3)。

Fig 3 Histochemistry staining of rat brain (×200)S: Sham; G: GMH; L: VU0360172 0.75 mg·kg-1; M: VU0360172 1.5 mg·kg-1; H: VU0360172 3.0 mg·kg-1.

2.4 VU0360172对GMH乳鼠大脑凋亡相关蛋白水平的影响Western blot结果显示，与假手术组相比，模型组脑中Bcl-2蛋白表达减少(P<0.05)，cleaved-caspase-3蛋白表达增加(P<0.01)。与模型组相比，VU0360172高剂量组明显上调Bcl-2蛋白(P<0.05)，下调cleaved-caspase-3蛋白(P<0.01)(Fig 4)。

Fig 4 Effect of VU0360172 on apoptosis-related proteinS: Sham; G: GMH; L: VU0360172 0.75 mg·kg-1; M: VU0360172 1.5 mg·kg-1; H: VU0360172 3.0 mg·kg-1. A, B: Relative protein expression level of Bcl-2 and cleaved-caspase-3 24h after GMH. *P<0.05, **P<0.01 vs sham; #P<0.05， ##P<0.01 vs GMH.

3 讨论

新生儿生发基质出血发生后，脑血管破裂出现大量血液，积血不仅会形成血块阻塞脑脊液循环，加重脑积水[1]，血液成分的释放还会引起神经元死亡[12]、小胶质细胞激活[13]、水通道蛋白表达改变[14]等病理反应，加剧脑损伤。

mGluR5是一种GPCR，在神经元细胞膜上表达，激动后具有抑制神经元凋亡，增强神经发生，调节小胶质细胞的功能，可产生抗炎、抗焦虑、抗精神病、抗癫痫的作用。有研究显示，mGluR5激动剂CHPG可增强脑室下区域神经祖细胞的增殖，增强神经发生，对成人脑出血产生保护作用[7]。在脑缺血模型上，特异性激动mGluR5可通过PI3K-AKT通路产生保护作用[8]。故mGluR5是一个可通过不同途径产生神经保护作用的受体。本研究结果发现，应用VU0360172后，可明显改善GMH所致的乳鼠脑含水量和脑血红蛋白含量的升高，并减少GMH造模后乳鼠神经行为学测试所消耗时间，降低神经功能缺陷评分。表明激活mGluR5后对GMH产生了治疗效果。

Georgiadis等[15]的研究显示，GMH的发病伴随着细胞凋亡，故抑制细胞凋亡可能是药物对GMH产生保护作用的一种途径。Zhang等[6]也发现，在蛛网膜下腔出血模型中，激动mGluR5可以改善早期损伤，并有抑制神经元凋亡的作用。故本研究提出假设，在GMH模型中激动mGluR5是否会产生凋亡抑制的效应？凋亡是一种细胞程序性死亡，只有当细胞凋亡程序启动时，半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)才会被激活，活化产生裂解的cleaved-caspase-3，裂解胞质和胞核底物，引起细胞凋亡，所以cleaved-caspase-3是细胞凋亡发生的重要指征和关键因子。而Bcl-2是重要的凋亡调控蛋白，Bcl-2的上调可抑制细胞凋亡。在本研究的WB结果中证实，GMH模型组的抗凋亡蛋白Bcl-2减少，裂解蛋白酶cleaved-caspase-3大量产生，说明细胞凋亡情况严重。给予VU0360172后，抗凋亡蛋白Bcl-2发生上调，而cleaved-caspase-3下调，细胞凋亡情况有所改善。综上，激动mGluR5后对GMH乳鼠产生了治疗效应，这种保护作用可能是通过抑制细胞凋亡所产生。

本研究主要聚焦于VU0360172激活mGluR5对GMH的保护作用，虽有其他研究也显示mGluR5激动剂对蛛网膜下腔出血、创伤性脑损伤等中枢疾病有保护作用，但也有研究表明抑制mGluR5可治疗帕金森[16]和阿尔茨海默症[17]。同一受体对不同神经疾病的治疗机制出现差异的原因，有可能是因为疾病本身的发病机制不同，急性创伤和慢性炎症性疾病存在差异，且因受mGluR5影响的下游通路众多，例如Akt-NF-κB通路[3]、PI3K-AKT通路等，受体可产生多种效应。本研究对mGluR5治疗GMH的机制探讨也仅是浅尝辄止，对其抑制细胞凋亡的具体机制尚不清楚，将在后续实验中对此进行更加深入的研究。