TNF-α 和lncRNA DLX6-AS1 在2 型糖尿病合并骨质疏松症患者血清中的表达及诊断价值

王迪，徐云，刘北彦，孟祥雨，白立炜，陈雪辉

（新乡医学院第一附属医院内分泌科一病区，河南 卫辉453100）

2 型糖尿病合并骨质疏松症是指糖尿病并发骨量减少，骨组织显微结构受损，骨脆性增加的全身代谢性骨病，严重威胁人类生命健康。 2 型糖尿病导致骨质疏松的发病机制尚未明确， 可能与糖尿病出现的高血糖、炎症反应等因素有关[1]。 肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）是重要的炎症介质，可增加血管通透性，刺激血管细胞增殖。 研究显示，TNF-α 与骨代谢密度相关，可能参与骨质疏松发生发展过程[2]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lnc RNA）是一类小分子非编码RNA，参与调控成骨细胞、破骨细胞的分化等骨代谢相关信号通路， 在骨质疏松发生发展中起重要作用[3-5]。 同源盒转录因子6 反义RNA 1（Distal-less homeobox 6 antisense RNA 1，DLX6-AS1）是一种lnc RNA，位于人类7 号染色体。研究显示，lnc RNA DLX6-AS1 在糖尿病肾病患者血清中表达升高， 其表达升高可能通过损伤足细胞介导糖尿病患者肾功能降低[6]。 目前，还未见lnc RNA DLX6-AS1 在2 型糖尿病合并骨质疏松症患者血清中表达的相关报道。 本研究主要探讨了TNF-α和lncRNA DLX6-AS1 在2 型糖尿病合并骨质疏松症患者血清中的表达水平， 并分析了其对该疾病的诊断价值， 以期为该疾病的诊断提供新的生物学指标。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017 年4 月至2018 年12 月于本院就诊的126 例2 型糖尿病患者为研究对象，诊断标准符合1999 年WHO 糖尿病诊断标准。纳入标准：（1）肝肾功能正常，无其他糖尿病并发症；（2）未接受任何糖尿病治疗；（3）无长期大量饮酒史。 根据骨密度测定结果分为单纯2 型糖尿病组 （72 例） 和2 型糖尿病合并骨质疏松症组（54例）。 单纯2 型糖尿病组男性32 例，女性40 例，平均年龄（56.38±7.54）岁。 2 型糖尿病合并骨质疏松症组男性25 例， 女性29 例， 平均年龄 （58.49±7.85）岁。另选取同时期60 例健康体检者作为对照组，男性26 例，女性34 例，平均年龄（57.64±7.29）岁。 本研究经医院伦理委员会批准同意，且患者自愿签署知情同意书。

1.2 检测指标 所有受试者测量身高和体重，计算身体质量指数（body mass index，BMI），BMI=体重/身高2（kg/m2）。 采集清晨空腹静脉血5 mL，全自动生化仪检测甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、 高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein- cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇 （low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），放射法测定空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）水平，DCA2000+糖化血红蛋白测定仪 （德国拜尔公司）测定糖化血红蛋白（HbA1c）。计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=（FBG×FINS）/22.5[7]。

1.3 骨密度测定 采用双能X 线骨密度仪 （美国GEPRODIGY 公司）测正位脊柱第2～4 腰椎、股骨颈、 大转子、 小转子、Ward 三角的骨密度（bone mineral density，BMD），以g·cm2表示。

1.4 酶联免疫吸附法测定血清TNF-α 水平 患者空腹静脉血置于抗凝管中，3500 r/min 离心10 min。 取上清， 参照TNF-α 试剂盒说明书检测TNF-α 水平。 试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.5 实时荧光定量PCR （RT-qPCR） 检测血清lncRNA DLX6-AS1 表达水平 Trizol 试剂提取血清中总RNA，微量核酸仪检测RNA 的浓度和纯度后，将其反转录为cDNA，具体操作参照反转录试剂盒。然后以cDNA 为模板，进行扩增。 扩增程序：95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃60 s， 共进行35 个循环。 引物序列：lncRNA DLX6-AS1 上游5′-CCACCCACTGAGAGAAGAGG-3′，下游5′-CCT CCAAGCAATTGTCCAGT-3′；GAPDH 上游5′-CGGAACGTGCCGTAGCTGAAA-3′， 下 游5′-GCCTGACAAGTGAATCTAC G-3′。 以GAPDH 为内参，2－△△Ct法 计 算lncRNA DLX6-AS1 的 相 对 表 达 水平。

1.6 统计学分析 利用SPSS 22.0 软件分析实验数据。 计量资料以均数±标准差（±s）表示。 两组间比较采用独立样本t 检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q 检验。 Pearson相关性分析2 型糖尿病合并骨质疏松症患者血清TNF-α 和lncRNA DLX6-AS1 表达水平与临床指标相关性，受试者工作特征（ROC）曲线分析TNFα 和lncRNA DLX6-AS1 对2 型糖尿病合并骨质疏松症的诊断价值，Logistic 回归分析2 型糖尿病合并骨质疏松症的影响因素。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较 健康对照组、单纯2 型糖尿病组和2 型糖尿病合并骨质疏松症组患者性别、年龄、BMI 及血清TC、LDL-C 和HDL-C 两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 与健康对照组比较，单纯2 型糖尿病组和2 型糖尿病合并骨质疏松症组患者血清TG、HbA1c、FBG、FINS 和HOMA-IR 升高（P＜0.05），BMD 降低（P＜0.05）。 单纯2 型糖尿病组比较，2 型糖尿病合并骨质疏松症组患者血清TG、HbA1c、FBG、FINS 和HOMA-IR 比 较 差 异 均无统计学意义（P＞0.05），BMD 降低（P＜0.05）。见表1。

表1 三组患者一般资料比较

2.2 三组患者血清TNF-α 和lncRNA DLX6-AS1表达水平 与健康对照组比较，单纯2 型糖尿病组和2 型糖尿病合并骨质疏松症组患者血清TNF-α和lncRNA DLX6-AS1 表达水平均升高（P＜0.05）。与单纯2 型糖尿病组比较，2 型糖尿病合并骨质疏松症组患者血清TNF-α 和lncRNA DLX6-AS1 表达水平均升高（P＜0.05）。 见图1、表2。

表2 三组患者血清TNF-α 和lncRNA DLX6-AS1 表达水平

图1 lncRNA DLX6-AS1 的PCR 扩增曲线

2.3 2 型糖尿病合并骨质疏松症患者血清TNF-α和lncRNA DLX6-AS1 与临床指标相关性分析 2型糖尿病合并骨质疏松症患者血清TNF-α、lncRNA DLX6-AS1 与FBG、FINS 和HOMA-IR 均呈正相关（P＜0.05），与BMD 呈负相关（P＜0.05）。 见表3。

表3 血清TNF-α 和lncRNA DLX6-AS1 与临床指标相关性分析

2.4 2 型糖尿病合并骨质疏松症患者血清TNF-α和lncRNA DLX6-AS1 诊 断 价 值 与TNF-α 或lncRNA DLX6-AS1 单独诊断比较， 二者联合检测诊断2 型糖尿病合并骨质疏松症的灵敏度、 特异度及准确度升高（P＜0.05）。 见图2、表4。

表4 TNF-α、lncRNA DLX6-AS1 及二者联合检测诊断2 型糖尿病合并骨质疏松症的价值

图2 TNF-α、lncRNA DLX6-AS1 及二者联合检测诊断2 型糖尿病合并骨质疏松症的ROC 曲线

2.5 Logistic 回归分析 Logistic 回归分析显示，lncRNA DLX6-AS1 是2 型糖尿病合并骨质疏松症的独立影响因素（P＜0.05）。 见表5。

表5 Logistic 回归分析结果

3 讨论

2 型糖尿病是一种以慢性高血糖为主要特征的代谢疾病。 随着社会经济及人民生活水平的提高，糖尿病发病率呈增长趋势[8]。 糖尿病患者骨质疏松发病率及骨折风险增加， 严重影响患者生活质量。 目前，糖尿病骨质疏松症的发病原因尚不明确。 探讨糖尿病骨质疏松症患者体内异常表达的因子可为疾病发生发展的机制及诊断和治疗提供新思路。

正常骨代谢的主要形式是骨重建， 当骨吸收增加、骨转换降低时可导致骨质疏松[9]。 TNF-α 是重要的炎性介质， 参与调节免疫应答、 炎症等过程，其大量产生和释放会破坏机体免疫平衡[10]。 有报道称，TNF-α 可抑制成骨细胞合成Ⅰ型胶原，诱导骨原细胞产生IL-1、IL-6 等炎性介质，促进破骨细胞生长，加速骨吸收[11]。本研究显示，单纯2 型糖尿病患者血清TNF-α 表达水平高于健康对照组，而2 型糖尿病合并骨质疏松症患者血清TNF-α 表达水平高于单纯2 型糖尿病患者， 与相关报道结果一致[12]，提示TNF-α 与2 型糖尿病合并骨质疏松症的发生发展密切相关。 骨骼肌中炎性因子的增加与机体糖代谢紊乱相关，TNF-α 是第一个被证实与胰岛素抵抗相关的炎症因子， 骨骼肌分泌的TNF-α 与葡萄糖的摄取和利用呈负相关[13]。 本研究显示，TNF-α 表达与骨密度呈负相关，与FBG、FINS 和HOMA-IR 均呈正相关，提示TNF-α表达升高可能使糖尿病患者骨密度降低， 增加骨质增殖发生概率。 血清TNF-α 单独诊断2 型糖尿病合并骨质疏松症的灵敏度、特异度、及准确度分别为64.81%、60.00%、62.28%和，单独诊断的价值不高，可能会造成漏诊。

lnc RNA DLX6-AS1 属于自然反义RNA，可在转录或转录后水平调控相应的正义mRNA，从而发挥生物学功能。 研究显示，lnc RNA DLX6-AS1在甲状腺癌、喉鳞状细胞癌、结直肠癌等肿瘤中表达升高，沉默其表达可抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，是肿瘤治疗的潜在靶点[14-17]。 目前，lnc RNA DLX6-AS1 在2 型糖尿病合并骨质疏松症患者中的表达及意义还未知。 本研究显示，2 型糖尿病合并骨质疏松症患者血清lnc RNA DLX6-AS1 表达水平均高于单纯2 型糖尿病患者和健康对照患者，其表达升高是影响该疾病的独立危险因素，提示lnc RNA DLX6-AS1 可能参与2 型糖尿病合并骨质疏松症的发生发展。 本研究还显示，lnc RNA DLX6-AS1 与骨密度呈负相关，其诊断2 型糖尿病合并骨质疏松症的灵敏度、 特异度及准确度分别为77.78%、75.00%、76.31%，说明lnc RNA DLX6-AS1 对该疾病具有较高的诊断价值。 联合检测TNF-α 和lnc RNA DLX6-AS1 时， 诊断2 型糖尿病合并骨质疏松症的灵敏度、 特异度及准确度分别为92.59%、90.00%、91.23%，均高于二者单独检测，提示联合检测血清TNF-α 和lnc RNA DLX6-AS1 水平对于2 型糖尿病合并骨质疏松症的诊断价值较高。

综上所述，TNF-α 和lnc RNA DLX6-AS1 在2型糖尿病合并骨质疏松症患者血清中表达升高，监测血清TNF-α 和lnc RNA DLX6-AS1 表达变化有助于评价该疾病的发展情况。 但本研究样本量较少，可能存在一定误差，还需要扩大样本量进一步说明二者与可能2 型糖尿病合并骨质疏松症的相关性，以期为该疾病的诊断提供新思路。