长江安庆段刀鲚的线虫感染现状及时间特征

代培，郭琦,田佳丽，马凤娇，王银平，刘凯*

(1.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 农业农村部淡水渔业和种质资源利用重点实验室，江苏 无锡 214081；2.江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017;3.南京农业大学 无锡渔业学院，江苏 无锡 214081)

刀鲚Coilianasus为溯河产卵的洄游型鱼类，在中国渤海、黄海和东海均有分布，每年2月刀鲚开始进入长江进行生殖洄游，繁殖完成后返回近海育肥[1]。刀鲚曾是长江下游重要的捕捞对象，20世纪70—80年代刀鲚在上海市、江苏省和安徽省的年平均捕捞量约为2 904 t，随着长江流域水利工程的兴建、水环境污染的加剧及捕捞强度的提高，刀鲚资源量出现急剧衰退，进入21世纪刀鲚鱼汛几近消失，其中，2001—2005年刀鲚年平均捕捞量下降为673 t，2010—2013年仅为116.6 t[2-4]。

线虫主要寄生于鱼的体腔、消化道、鳃、肝脏、鳔和生殖腺等部位。线虫寄生鱼体后，感染部位会组织加厚、充血或出血，线虫在鱼体内生长和移行会造成大脑、心脏等重要器官损伤，有的线虫以宿主的血液为食，会造成宿主明显消瘦，这些损伤可造成鱼类发育不良，影响鱼类繁殖，甚至导致鱼类死亡，对鱼类种群的补充产生较大影响[5]。对刀鲚寄生线虫的调查研究最早始于20世纪70年代，徐屷南等[6]研究认为，简单异尖线虫仅感染长江刀鲚，可作为洄游型刀鲚的“生物指标”。Li等[7]利用长江口刀鲚感染简单异尖线虫等4种海水性寄生虫的强度变化规律来探究刀鲚上溯洄游和降海洄游的时间。为进一步确认刀鲚感染线虫的种类，刘凯[8]利用分子鉴定的方法确认感染刀鲚的线虫共有6种，均为海水性寄生虫，其中，异尖属2种，宫脂属4种，优势种为派氏异尖线虫Anisakispegreffii。目前，未见对洄游汛期内刀鲚感染线虫现状开展连续调查的报道。本研究中，于2018年4—7月在长江安庆段对刀鲚的线虫寄生现状开展连续调查，分析长江刀鲚的线虫感染现状及其时间特征，以期为后续开展长江刀鲚种群补充的影响研究提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 样本采集站位与时间

于2018年4月18日至7月15日，在长江下游安庆段设置4个采样点,逐日开展刀鲚样本采集(图1)，受天气等因素的影响，部分日期未开展调查，实际调查时间为72 d。调查网具为流刺网，由2层衬网和1层内网组成，网长、网高分别为200、2.8 m，内网和衬网网目分别为3、28 cm。调查期间，将流刺网一端固定于一艘渔船，另一艘渔船完成下网并固定网具的另一端，以顺水方向开始拖网。同步测定水体的浊度、溶解氧(DO)、温度和pH。

图1 刀鲚调查区示意图Fig.1 Sketch of sampling regions for investigation of estuarine tapertail anchovy Coilia nasus

1.2 方法

1.2.1 样本处理 现场采集1 658尾刀鲚样本，经统一编号后进行表观生物学测定。仔细检查刀鲚鳃、体表、腹腔、围心腔膜、性腺膜、肝脏及消化道内外等处的线虫，全数采集计数并保存于无水乙醇中。此外，随机抽取1 044尾刀鲚，统计线虫在其体内各个部位的分布情况。

1.2.2 线虫分子鉴定 从采集到的线虫样本中随机抽取252条作为分子鉴定样本，其中4—7月每月抽取数量分别为60、69、63、60条。使用TIANamp Marine Animals DNA Kit提取线虫DNA，-20 ℃冰箱中冻存。采用保守引物扩增ITS1-5.8S-ITS2序列，引物序列为NC5-ITS-R(5′TAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT 3′)和NC2-ITS-F(5′TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT 3′)[8]，模板为线虫总DNA。PCR反应体系(30 μL)：上、下游引物各1.2 μL，DNA模板2 μL，2×Premix Taq (TaKaRa)15 μL，用ddH2O补足至30 μL。PCR扩增条件：95 ℃下预变性5 min；94 ℃下循环变性45 s，56 ℃下退火复性30 s，72 ℃下延伸1 min，共进行35个循；最后在72 ℃下延伸10 min。取PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，将凝胶条带大小与预期结果相符的样品送至无锡亦欣生物技术有限公司测序。将测序结果登录NCBI进行Blast对比分析。

1.2.3 寄生生态学指标的测定与计算 参照Bush等[9]和吴金英等[10]的方法，使用以下寄生生态学指标：

感染率=寄生线虫的宿主数/检查的宿主总数×100%，

感染强度=检查到的线虫数/寄生线虫的宿主总数，

感染丰度=检查到的线虫数/检查的宿主总数。

1.3 数据处理

试验数据以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，用Duncan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 水体理化参数

各时段水体理化指标见表1,调查水域水体浊度平均值为(31.56±13.14)NTU，溶解氧质量浓度平均值为(6.92±0.55)mg/L，水温平均值为(24.65±2.83)℃，pH平均值为(7.71±0.19)。

表1 调查水域水体理化指标的时间特征Tab.1 Characteristics for environmental parameters in different months

2.2 刀鲚生物学特征

现场采集的1 658尾刀鲚样本，颌骨长均大于头长。其中，左颌骨长/头长的平均值为(1.18±0.09)mm，右颌骨长/头长的平均值为(1.17±0.09)mm；全长为176.47～397.86 mm，平均值为(273.22±24.27)mm；体长为162.41～394.72 mm，平均值为(252.68±23.31)mm；体质量为18.09～157.22 g，平均值为(53.27±16.51)g；雌雄比为0.97(表2)。

2.3 刀鲚感染线虫的频率分布

调查采集的刀鲚样本中感染个体为1 575尾，感染率为96.32%。所有感染样本中共检出线虫16 838条，平均感染强度为(10.69±9.67)条/尾，平均感染丰度为(10.16±9.67)条/尾，感染线虫数量最多个体为2018年6月11日采集的1尾体质量51.05 g的刀鲚，共检出线虫145条。在所有感染线虫的刀鲚样本中，寄生数量介于1～9条的个体最多，占比为52.53%；寄生数量大于30条的个体共计62尾，占比为3.93%；大于100条的共2尾，占比为0.12%(图2)。

图2 线虫在刀鲚中的频率分布Fig.2 Percent of host infection in different number of estuarine tapertail anchovy Coilia nasus

2.4 不同规格刀鲚的线虫寄生特征

将刀鲚样本按体长分为7组，各体长组刀鲚的线虫感染情况分析显示，小于200 mm体长组的感染率最低(87.50%)，280～300 mm体长组的感染率最高(97.50%)，当刀鲚体长大于300 mm时，线虫感染率下降明显(图3(a))。平均感染强度和平均感染丰度随体长增加的变化趋势较为一致，其中，两个指标均在260～279 mm体长组最高，在体长<200 mm组最低，且随体长增加均表现为先升高后下降趋势(图3(b))。

标有不同字母者表示同一指标下不同组间有显著性差异,标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同。Note:Means with different letters in same index are significant differences in different groups at the 0.05 probability level,and the means with the same letter are not significant differences,et sequentia.图3 不同体长组刀鲚中线虫的感染强度和感染丰度Fig.3 Infection intensity and abundance of nematodes for estuarine tapertail anchovy Coilia nasus in different body length groups

2.5 不同采样时间刀鲚的线虫寄生特征

随着时间推移，刀鲚的线虫感染率、平均感染强度和平均感染丰度均呈现出先升后降的趋势。感染率在6月上半月最高(98.32%)，其次是5月下半月(96.75%)，最低值在4月下半月(89.36%)(图4(a))。平均感染强度和平均感染丰度的变化趋势一致，二者均在6月上半月最高，分别为(12.04±11.64)、(11.84±11.65)条/尾，最低值则出现在4月下半月，分别为(6.90±6.13)、(6.17±6.18)条/尾，其中，平均感染强度和平均感染丰度在6月上半月均出现显著性上升(P<0.05)，平均感染强度在7月上半月出现显著性下降(P<0.05)，平均感染丰度在6月下半月出现显著性下降(P<0.05)(图4(b))。

图4 线虫寄生指标的时间特征Fig.4 Infection of characteristics for nematodes in different months

2.6 刀鲚中线虫的寄生部位

从随机抽取的1 044尾感染刀鲚样本中共检出线虫10 782条，按寄生部位统计附着或嵌入各组织内的线虫数量。线虫寄生于腹腔内壁、肝脏、肠道、胃、幽门盲囊和性腺，其中，线虫分布数量最多的为肠道，共检出线虫4 449条，占检出线虫总数的41.26%，其次为幽门盲囊，检出线虫数量为3 359条，占比为31.15%，线虫分布数量最少的是胃，仅检出69条，占比为0.64%(图5、图6)。

图5 刀鲚体内线虫的分布情况Fig.5 Distribution of nematodes in estuarine tapertail anchovy Coilia nasus

2.7 线虫的种类组成

分子鉴定结果显示，刀鲚感染的线虫共6种，其中，异尖属线虫2种，分别为派氏异尖线虫Anisakispegreffii和简单异尖线虫A.simplex，宫脂属4种，分别为内弯宫脂线虫Hysterothylaciumaduncum、费氏宫脂线虫H.fabri、中华宫脂线虫H.sinens和厦门宫脂线虫H.amoyense，派氏异尖线虫数量最多，占抽样线虫总数的71.83%，其次是内弯宫脂线虫，占比为8.73%，厦门宫脂线虫最少，占比为0.40%。派氏异尖线虫电镜图见图7。

A—线虫寄生于刀鲚的肠道；B—线虫寄生于刀鲚的肝脏；C—线虫寄生于刀鲚的幽门盲囊；D—线虫游离于刀鲚的腹腔内壁；E—嵌入线虫的刀鲚肝脏。A—parasitize the intestines；B—parasitize the liver；C—parasitize the pyloric caeca;D—parasitize the abdominal wall；E—liver embedded in nematodes.图6 刀鲚中线虫的寄生部位Fig.6 Parasitic pattern of nematodes in estuarine tapertail anchovy Coilia nasus

3 讨论

3.1 长江安庆段刀鲚感染线虫现状

刀鲚作为典型的江海洄游型鱼类及长江下游流域名贵的经济鱼类，兼具生态和经济价值。本次调查显示，长江安庆段刀鲚线虫感染率极高，达到96.32%，平均感染强度和平均感染丰度分别为(10.69±9.67)、(10.16±9.67)条/尾，上述3项指标均高于2011年和2017年长江安庆段刀鲚线虫感染调查结果[8,11]。刀鲚感染情况较为严重，考虑到本次调查基本覆盖了当年安庆段整个刀鲚洄游汛期，且解剖并统计了所有采集的样本，故调查结果具有代表性。本研究中，刀鲚寄生线虫分子鉴定结果显示，刀鲚感染线虫共6种，其中，异尖属2种，宫脂属4种，均为海水性寄生虫[12]，这同2016年长江下游刀鲚感染线虫的物种相一致[8]。刀鲚洄游至长江后，一方面长江定居鱼类和甲壳类感染线虫较少[13-14]，另一方面刀鲚洄游过程中一般不摄食，故其感染淡水性线虫的概率极低，这也与已有研究结果相符[8,11]。异尖科线虫在海洋鱼类中的感染率较高[15-17]，其寄生于海洋哺乳类后发育成熟，刀鲚作为中间宿主，其感染的线虫均为幼虫，不会在刀鲚体内繁殖[18]，刀鲚体内寄生的异尖科线虫均因在近海摄食感染。刀鲚溯河进入淡水后，远离感染源，因此，异尖线虫感染情况应反映出其在近海生活期间栖息水域中磷虾等饵料生物的线虫感染情况较为严重。

A—头部，正面观；B—头部，侧面观；C—尾部，侧面观；D—尾尖。A—cephalic extremity,front view;B—cephalic extremity,lateral view;C—posterior region,lateral view;D—tip of tail.图7 派氏异尖线虫电镜图Fig.7 Electronic microscope diagraph of parasite Anisakis pegreffii

线虫主要寄生于刀鲚腹腔内，受洄游产生的渗透压及外界水环境变化的影响较小，就刀鲚个体而言,在洄游过程中其线虫感染强度不会发生显著变化[19]。但刀鲚洄游群体平均感染强度则可能在洄游过程中发生改变，其变化可能来自感染严重的个体因损伤严重而导致死亡，进而导致整体感染强度下降[20]。此外，仅有少数宿主感染寄生虫数量大，而大多数宿主感染数量较少的这种寄生特征是寄生虫与宿主相互关系的一种普遍形式，这对于宿主和寄生虫都较为有利[21]。

本研究显示，刀鲚因摄食而感染线虫，除胃、肠道和幽门盲囊内有线虫寄生外，刀鲚的肝脏、性腺、腹腔内壁及肠系膜均有线虫附着寄生，由此可见，线虫在刀鲚体内会发生转移，这可能是受线虫密度的影响，也可能是线虫个体发育所需[22]。从刀鲚各部位线虫寄生比例来看，在肠道和幽门盲囊的寄生占比较高，分别为41.26%和31.15%。线虫经胃肠行移至刀鲚腹腔各器官，可能会引起消化道等组织损伤，进而引发炎症等免疫反应。进入腹腔后线虫则会嵌入或刺穿刀鲚肝脏等脏器，产生直接损伤或导致肝脏纤维化等损伤[23]。

3.2 长江安庆段刀鲚感染线虫的宿主差异

本研究显示，在所有的感染样本中，小规格体长组(<240 mm)线虫感染率明显低于较大规格体长组，感染强度和感染丰度也表现出了同样的趋势，这种趋势在黄颡鱼寄生虫感染和黄鳝胃瘤线虫感染情况中也同样出现[24-25]。刀鲚感染的6种线虫均为海水性寄生虫，且均来自外源摄入。由于小规格刀鲚在近海生活的时间较短，经捕食摄入线虫的概率相对低于大规格个体，这与小规格个体感染指标均低于较大规格个体是相符的。此外，本研究中还发现，线虫感染数量大于40条/尾的刀鲚体长和体质量均显著小于其他组，这应与寄生线虫对刀鲚的影响有关，线虫寄生于刀鲚体内依靠其营养物质生存，且对刀鲚的肠道、肝脏等组织产生损伤,从而影响刀鲚生长。

3.3 长江安庆段刀鲚感染线虫的时间特征

本研究显示，刀鲚的线虫感染情况在不同时间段有所差异，随着时间的推移，整体上刀鲚的线虫感染率、感染强度和感染丰度均呈现先升后降的趋势，3项指标均在6月上半月达到峰值，最低值则均出现于4月下半月，这种不同时间段感染特征应与刀鲚洄游群体的洄游习性有关。刀鲚2月初自长江口向长江进行生殖洄游，4月初长江安庆段陆续出现洄游型刀鲚，刀鲚感染线虫的时间特征可能同刀鲚生活海域异尖线虫暴发的时间相关。此外，刀鲚的线虫感染强度与刀鲚个体规格相关，本研究中，刀鲚规格随时间变化特征同其感染线虫的时间特征趋势较为一致，整体上均呈现出先升高后降低的趋势，2018年刀鲚专项捕捞尚未停止，受捕捞压力影响，早期捕获的刀鲚规格较小，而小规格刀鲚感染线虫的概率较低，故其线虫感染指标较低。长江安徽段刀鲚专项捕捞许可时段为4月27日—5月26日，随着下游江段刀鲚许可捕捞逐渐停止[4]，刀鲚渔获规格呈增大趋势，在6月上半月达到最大，这同刀鲚感染线虫情况的变化趋势一致，后期随着刀鲚洄游汛期接近末期，刀鲚资源量下降，捕获的刀鲚渔获规格也出现下降，其线虫感染指标也开始下降。刀鲚感染线虫的时间变化特征同刀鲚渔获规格变化趋势一致，也较好地印证了刀鲚感染线虫的时间、规格与感染强度的关系。

4 结论

1)刀鲚的线虫感染率较高，但感染严重的个体数占比较小，52.53%的刀鲚感染线虫数量介于1～9条。

2)刀鲚因摄食感染线虫，其肠道和幽门盲囊的线虫数量占比较高，且线虫在刀鲚体内会发生行移，在其肝脏、性腺、腹腔内壁等处也有寄生。

3)刀鲚中寄生的线虫共有6种，均为海水性寄生虫，优势种为派氏异尖线虫。

4)刀鲚的规格和洄游时间与其线虫感染有一定的相关性，其中线虫感染强度随刀鲚体长的增加及洄游时间的后移均表现出先升高后降低的趋势。