结直肠癌中5′tiRNA-Val-CAC对增殖的影响及病理意义

周 洁, 王 磊, 王成海

(1. 扬州大学附属医院 病理科, 江苏 扬州, 225000;2. 扬州大学医学院 病理教研室, 江苏 扬州, 225002)

结直肠癌(CRC)又称大肠癌, 是消化系统最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第4大原因[1]。CRC的早期筛查和诊断主要基于光纤结肠镜检查结果和粪便隐血检测结果，然而结肠镜检查费用昂贵且具有侵入性，粪便隐血检测则具有敏感性和器官特异性不高的缺点[2]。因此，临床亟需探寻一种针对CRC的简单、无创、诊疗效率高的生物标志物。转运RNA衍生的小RNA(TDSR)是转运RNA(tRNA)的片段，其长度通常为14～50个核苷酸(nt)。TDSR失调与多种人类疾病有关，如癌症、病毒感染、代谢紊乱和神经退行性疾病[3-4]。研究[4]表明, CRC患者血浆TDSR中的5′-tRF-Gly-GCC水平高于健康对照者，可作为CRC的一种诊断生物标志物，且TDSR表达谱分析结果显示5′tiRNA-Val-CAC表达水平升高。本研究探讨5′tiRNA-Val-CAC在CRC组织和CRC细胞中的表达情况、病理意义及其对CRC细胞生长与增殖的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月—2021年12月在扬州大学附属医院接受CRC根治术并经病理检查确诊CRC的82例患者作为研究对象，男56例，女26例，年龄44～71岁，中位年龄55岁。纳入标准: ① 临床资料、病理资料无缺失者; ② 经病理检查明确诊断CRC者; ③ 术前未接受放疗、化疗、免疫治疗等抗肿瘤治疗者; ④ 对本研究知情同意者。排除标准: ① 合并其他部位恶性肿瘤者; ② 妊娠期或哺乳期女性; ③ 自身免疫性疾病、感染性疾病患者。选取82例患者的CRC组织进行检测，同时选取各患者对应的距癌组织5 cm 处的正常结直肠组织作为对照(所有癌旁正常组织经苏木精-伊红染色明确无CRC细胞)。本研究经扬州大学附属医院伦理委员会审核备案(2022-YKL2-21-006)。

1.2 细胞和质粒

CRC细胞系SW620、HCT116和正常人肠上皮细胞(HIEC)均购于中科院上海细胞库。培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基(HyClone 公司)，培养基中添加1%的青链霉素(Invitrogen公司)。将细胞置于37 ℃、5%CO2的潮湿培养箱中培养。5′tiRNA-Val-CAC模拟物或抑制剂相关质粒和对照组质粒均购自上海生工生物科技有限公司。使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen公司)将相关质粒转染到CRC细胞中，分为过表达5′tiRNA-Val-CAC组(过表达组)、Scramble对照组、敲低5′tiRNA-Val-CAC组(敲低组)和正常对照组。

1.3 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)实验

使用TRIzol试剂(Invitrogen 公司)分离总RNA[260 nm处光密度与230 nm处光密度的比值(OD260 nm/OD230 nm)>1.8]。根据试剂盒说明书要求，使用Prime-Script First cDNA试剂盒(Takara公司)将总RNA逆转录为互补DNA(cDNA)。按照qRT-PCR试剂盒(Takara公司)说明书在Applied Biosystems 7500 PCR仪器上进行qRT-PCR实验。反应条件: 预变性95 ℃ 30 s, 然后95 ℃ 5 s→60 ℃ 45 s，共计40个聚合酶链反应(PCR)扩增循环，非编码RNA(ncRNA)的内参为U6，信使RNA(mRNA)的内参为GAPDH。所得实验数据均与内参对比后再进行统计学分析。5′tiRNA-Val-CAC上游引物为ACGGAACCUUUCGCAGCG, 下游引物为ACGTGCTTCTGTAGTGTAGT。

1.4 RNA原位杂交技术(RISH)检测5′tiRNA-Val-CAC表达

82例CRC癌组织标本进行RISH实验，实验步骤按照原位杂交试剂盒(武汉博士德公司)说明书进行。5′tiRNA-Val-CAC探针序列为GCTTC

TGTAGTGTAGTGGTT和TGGTTATCACGTTCGCCTC。根据每张癌组织切片5个高倍视野下5′tiRNA-Val-CAC阳性细胞计数占比情况将82例CRC患者分为高表达组与低表达组，其中低表达组的5′tiRNA-Val-CAC阳性细胞占比<5%, 高表达组的5′tiRNA-Val-CAC阳性细胞占比为5%～100%。

1.5 CCK-8实验检测细胞增殖活性

将96孔白板横向孔依次标注数字1→12，纵向孔依次标注英文字母A→H, 实验接种选择孔为横向3→10孔、纵向B→F孔。3B→3E孔为培养液组, 4B→4E孔为正常癌细胞+培养液组(空白对照), 5B→5E孔为过表达组, 6B→6E孔为Scramble对照组(过表达组的对照细胞组); 7B→7E孔为敲低组，4B→4E孔为正常对照组(敲低组的正常细胞对照组)。

将SW620细胞悬浮于96孔板的孔洞里，每个孔洞加入100 μL[(4～5)×103个细胞]，设置3个复孔(D→E)。将细胞置入5%CO2、37 ℃的培养箱里中培养，直至铺满整个孔底。每个孔中加入CCK-8溶液10 μL, 轻轻击打培养板使细胞与溶液混匀，于细胞培养箱中孵育4 h。使用酶标仪于450 nm处检测光密度(OD)值，分析敲低、过表达5′tiRNA-Val-CAC对细胞增殖活性的影响。

1.6 细胞克隆平板实验

将各组SW620细胞接种于6孔板中(10 000个/孔)，每2 d更换1次培养基，培养2周后，弃培养基。在4%多聚甲醛固定30 min后用0.4%结晶紫染色20～30 min, 于光学显微镜下观察，对细胞克隆数目进行计数。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 5′tiRNA-Val-CAC在不同组织和细胞中的相对表达量

qRT-PCR实验结果显示，82例CRC组织中5′tiRNA-Val-CAC相对表达量为(3.69±0.52), 高于癌旁正常组织(设定相对表达量数值为1), 差异有统计学意义(t=9.111,P=0.012); CRC细胞系SW620、HCT116中5′tiRNA-Val-CAC相对表达量分别为(4.18±0.46)、(3.47±0.68), 均高于HIEC细胞(设定相对表达量数值为1)，差异有统计学意义(t=11.475、7.158,P=0.008、0.019), 见图1。

两者比较, *P<0.05。图1 5'tiRNA-Val-CAC在不同组织和细胞中的相对表达量

2.2 CRC组织与癌旁正常组织中5′tiRNA-Val-CAC阳性表达情况

RISH实验结果显示, CRC组织中阳性表达的5′tiRNA-Val-CAC为棕黄色颗粒，大小不一，以细胞质染色为主, 5′tiRNA-Val-CAC在癌旁正常组织中为阴性表达或极少阳性表达，见图2。CRC组织中5′tiRNA-Val-CAC阳性表达率为82.93%(68/82), 癌旁正常组织中5′tiRNA-Val-CAC阳性表达率为7.32%(6/82), 差异有统计学意义(χ2=31.444,P<0.001)。

A、B: 5'tiRNA-Val-CAC在CRC组织中阳性表达(阳性物质为棕黄色颗粒,位于细胞浆中); C: 5'tiRNA-Val-CAC在癌旁正常组织中阴性表达。图2 RISH检测5'tiRNA-Val-CAC在不同组织中的表达情况(光学显微镜,放大200倍)

2.3 5′tiRNA-Val-CAC阳性表达与临床病理特征的关系

将5′tiRNA-Val-CAC阳性细胞占比<5%的30例CRC患者纳入低表达组，将5′tiRNA-Val-CAC阳性细胞占比为5%～100%的52例CRC患者纳入高表达组。高表达组肿瘤直径≥3 cm者、中低分化者占比高于低表达组，差异有统计学意义(P<0.05), 2组其他方面比较，差异无统计学意义(P>0.05), 见表1。由此表明, 5′tiRNA-Val-CAC高阳性表达与CRC患者肿瘤直径和分化程度具有相关性(P<0.05), 与患者性别、年龄、发病部位、浸润深度、淋巴结转移和TNM 分期无相关性(P>0.05), 见表1。

表1 结直肠癌组织中5′tiRNA-Val-CAC表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.4 5′tiRNA-Val-CAC对CRC细胞增殖与生长的影响

过表达组72 h时的OD450 nm高于Scramble对照组，敲低组72 h时的OD450 nm低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05); 细胞克隆平板实验显示，过表达组细胞克隆数目多于Scramble对照组，敲低组细胞克隆数目少于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3、表2。由此表明，过表达5′tiRNA-Val-CAC后细胞增殖活性增强、细胞克隆数目增多，而敲低5′tiRNA-Val-CAC表达后细胞增殖活性下降、细胞克隆数目减少，即5′tiRNA-Val-CAC能促进CRC细胞增殖与生长。

A、B: 各组细胞不同时点增殖活性(2组比较, *P<0.05); C: 各组细胞克隆平板实验结果。图3 5'tiRNA-Val-CAC对SW620细胞增殖与生长的影响

表2 各组SW620细胞增殖与生长情况比较

3 讨 论

在中国, CRC是第3大常见的消化系统癌症[1]。每年死于CRC的患者人数占全球死亡人数的9.2%, CRC患者5年生存率和10年生存率分别为65%和58%, 死亡原因多为CRC转移与复发。近年来, CRC(尤其是直肠癌和远端结肠癌)的总体发病率有所下降，但50岁以下人群的CRC发病率有所上升[5]。通过早期发现、切除癌前病变与腺瘤和广泛的CRC筛查, CRC的发病率和病死率均明显下降[6]。目前研究[7]认为, CRC的诱因包括肥胖、少膳食纤维饮食、长期炎症性肠病以及肠道微生物群改变。

tRNA是一种经典的ncRNA[8]，负责将mRNA上的遗传信息翻译为新生的蛋白质。在激素、缺氧和应急等生理和病理条件下，tRNA可衍生出许多的片段，包括tiRNAs和tRFs, 这些tRNA衍生片段的重要功能正逐渐被发现，并能作为信号分子和基因表达的调控因子调节肿瘤、代谢性疾病和神经系统疾病等的病理过程[9-10]。SHAO Y等[11]报道, tRF-Leu-CAG在非小细胞肺癌中表达水平升高，能导致G0/G1细胞周期进展，从而促进癌细胞增殖。CRC中tRF/miR-1280表达水平下调，过表达tRF/miR-1280会抑制CRC细胞的增殖和集落形成，而敲低tRF/miR-1280会促进CRC细胞的增殖和集落形成[12]。KIM H K等[13]研究结果表明，抑制3′tRNA-Leu-CAG可诱导肝癌细胞凋亡，但在体内不能诱导正常肝细胞凋亡。ZHAO C M等[14]在透明细胞肾癌患者血清中分离了5种5′-tRNA, 且其表达水平均下调，表明其可能为肿瘤抑制因子。在乳腺癌中, tRFs可调节癌细胞的侵袭、转移和增殖[15]。相关研究[4]TDSR表达谱分析结果显示CRC患者5′tiRNA-Val-CAC表达上调，故本研究进一步观察了5′tiRNA-Val-CAC在CRC组织中的表达情况，并分析5′tiRNA-Val-CAC与CRC患者临床病理特征的关联性及其对CRC细胞生长与增殖的影响。

本研究通过RISH实验发现, 5′tiRNA-Val-CAC在大多数CRC组织中呈阳性表达，且qRT-PCR实验结果显示, 5′tiRNA-Val-CAC在CRC组织和CRC细胞株中表达水平升高，提示5′tiRNA-Val-CAC在CRC的发生发展过程中起着促癌基因的作用。进一步分析5′tiRNA-Val-CAC阳性表达与CRC患者临床病理特征的关系发现, 5′tiRNA-Val-CAC高阳性表达与肿瘤大小和分化程度密切相关，而与患者性别、年龄、发病部位、浸润深度、淋巴结转移和TNM 分期无相关性。由此表明，5′tiRNA-Val-CAC可能与肿瘤的增殖和分化有关，即5′tiRNA-Val-CAC在CRC中表达水平越高，肿瘤细胞分化越低，越能增殖生长，进一步说明5′tiRNA-Val-CAC属于促癌基因，可影响CRC的进展和预后。未来进一步实验后, 5′tiRNA-Val-CAC或可成为CRC生长的生物标志物，用于CRC的诊断和预后评估。TNM分期中的T代表原发肿瘤的大小和浸润深度，但本研究结果显示5′tiRNA-Val-CAC表达与CRC的TNM分期无关，这可能是因为本研究划分的肿瘤直径大小与TNM分期原发肿瘤大小不一致且本研究标本数量偏少。

本研究尚存在不足之处，例如仅在功能方面对5′tiRNA-Val-CAC进行相关研究，而未验证5′tiRNA-Val-CAC的下游靶基因，也未研究5′tiRNA-Val-CAC影响CRC细胞生长与增殖的具体分子信号通路，故未来还应继续深入探讨5′tiRNA-Val-CAC对CRC细胞增殖的具体调控机制等。

综上所述, 5′tiRNA-Val-CAC是一种新的促癌基因，在CRC组织中高表达，能促进CRC细胞的生长与增殖。今后, 5′tiRNA-Val-CAC或可成为CRC增殖的分子标志物，用于CRC的诊断和预后判断。