MASP-1联合血栓分子标志物对脓毒症合并DIC的诊断价值

任晓庆 李琪 闫本纯 马思琦 李晨 李春燕 樊金宇 闫海润

弥散性血管内凝血（DIC）是感染性疾病危及生命的严重并发症。据报道，脓毒症患者合并DIC的发生率达30%～50%，并且其死亡率增加1倍[1]。典型的DIC诊断并不难，但诊断时往往已发展至中晚期，死亡率较高，故寻找能够早期诊断脓毒症合并DIC的新型标志物至关重要。当病原菌入侵机体，免疫系统激活、炎症介质和组织因子大量释放，随后引发凝血级联反应，这被认为是脓毒症引发DIC的主要病理生理机制[2，3]。

补体系统是非特异性免疫系统的重要组成部分。补体系统包括经典途径、旁路途经和凝集素途径，其中MASP-1是凝集素途径的重要蛋白酶，凝集素途径会识别病原体表面上的碳水化合物，导致MASP-1激活，随后激活补体的共同途径[4]。MASP-1是炎症反应中凝血系统和补体系统之间的重要交叉点，由于其具有类似凝血酶的活性，它能够裂解纤维蛋白原和凝血因子ⅩⅢ[5]，从而激活凝血系统；随后纤维蛋白的形成和凝血因子的释放亦可激活补体系统，使补体蛋白MASP-1的表达增加，最终导致凝血和补体级联反应的激活进一步增强。脓毒症DIC的发生发展主要归因于补体系统和凝血系统的功能紊乱。因此，补体蛋白MASP-1在脓毒症合并DIC中具有重要的调控作用。在细胞实验和动物实验等基础实验中，MASP-1与凝血系统之间的关系已得到证实[6，7]，然而，尚缺乏验证这一观点的临床研究。本研究探讨MASP-1与脓毒症患者凝血功能紊乱的关系，分析MASP-1与TAT、TM、t-PAIC三项血栓分子标志物之间的相关性，评估其对脓毒症合并DIC的早期诊断价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取我院2019年10月～2021年8月收治的脓毒症患者，参照脓毒症3.0诊断标准[8]；排除年龄小于18岁、怀孕、重大创伤或手术、2周内使用过抗凝药物、恶性血液系统疾病、自身免疫性疾病、严重肝肾疾病、恶性肿瘤等患者。本次研究符合收集标准的患者共106例，其中男58例，女48例，平均年龄（63.06±13.42）岁。按国际血栓与止血协会标准（ISTH）[9]，将患者分为DIC组（23例）和非DIC组（83例）。DIC组男14例，女9例，平均年龄（67.37±15.77）岁；高血压10例，糖尿病4例，冠心病7例。非DIC组男44例，女39例，平均年龄（66.18±15.47）岁；高血压29例，糖尿病11例，冠心病26例。以同期门诊健康体检者60例作为对照组，其中男34例，女26例，平均年龄（59.33±11.02）岁。三组之间年龄和性别差异无统计学意义（P>0.05），且DIC组与非DIC组之间基础疾病差异无统计学意义（P>0.05），均具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会审核批准，患者或其家属签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样本收集 连续收集被确诊为脓毒症患者的血浆，对患者临床资料进行动态观察，将符合DIC诊断标准的患者纳入DIC组，否则纳入非DIC组。用含0.3ml 3.2%枸橼酸钠抗凝剂的采血管抽取患者及对照组的血液2.7ml，上机离心10min（3 000r/min），将上层血浆转移至新的离心管中，30min内于-80℃冰箱冻存。检测前所有样本1次室温复溶后检测。

1.2.2 检测方法 MASP-1的测定采用酶联免疫测定法，仪器为Infinite M200 PRO多功能酶标仪，试剂为MASP-1酶联免疫分析试剂盒。TAT、TM和t-PAlC的测定采用化学发光免疫分析法，仪器为HISCL-5000全自动化学发光仪器，试剂为配套化学发光试剂。

1.3 统计学分析 采用SPSS 23.0软件对各组数据进行分析。呈偏态分布的计量资料用M（P25，P75）表示，计数资料的组间比较采用χ2检验。绘制受试者工作特征曲线（ROC曲线），以判断各项标志物的诊断性能。相关性分析采用Spearman秩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血浆中MSAP-1、TAT、TM和t-PAIC表达水平比较 DIC组患者血浆中MASP-1、TAT、TM和t-PAIC表达水平均高于非DIC组，差异有统计学意义（P<0.05）；且两组患者上述各指标水平均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。

表1 三组血浆中MSAP-1、TAT、TM和t-PAIC表达水平比较（±s）

表1 三组血浆中MSAP-1、TAT、TM和t-PAIC表达水平比较（±s）

注：与对照组相比，*P<0.05；与非DIC组相比，#P<0.05

组别 n MASP-1（μg/ml） TAT（ng/ml） TM（TU/ml） t-PAIC（ng/ml）对照组 60 12.9（9.13，15.3） 1.81（1.18，3.49） 8.54（7.41，10.04） 6.36（4.56，8.45）非DIC组 83 28.7（19.9，37.6）* 5.1（3.0，8.1）* 14.0（10.0，20.0）* 13.1（7.7，21.6）*DIC组 23 35.3（26.2，41.6）*# 11.6（3.6，25.0）*# 19.2（12.3，33.4）*# 21.1（13.7，32.8）*#

2.2 MASP-1与TM、TAT、t-PAIC的相关性 Spearman相关性分析显示，脓毒症患者MASP-1水平与TAT水平呈正相关（r=0.7447，P<0.001），与TM水平正相关（r=0.6362，P<0.001），与t-PAIC水平呈正相关（r=0.6241，P<0.001），见图1。

图1 MASP-1与TM、TAT、t-PAIC的相关性

2.3 MASP-1、TAT、TM和t-PAIC对脓毒症合并DIC的诊断效能 采用ROC曲线分析MASP-1、TAT、TM和t-PAIC对脓毒症合并DIC的诊断效能，曲线下面积分别为0.695、0.705、0.674、0.661；MASP-1和TAT、TM、t-PAIC联合检测的曲线下面积最大（0.751），敏感度为51.0%，特异性为87.6%，见表2、图2。

图2 各分子标志物诊断脓毒症合并DIC的ROC曲线

表2 各分子标志物对脓毒症合并DIC的诊断价值

3 讨论

脓毒症发生时，由于病原菌入侵，机体固有免疫系统激活，导致凝血和补体级联反应增强，严重者会发生全身微血管血栓形成，进而引起脓毒症合并DIC。脓毒症合并DIC的病理生理机制较为复杂，是多种因素共同作用的结果。凝集素途径在先天性免疫中具有重要意义，并且补体蛋白MASP-1与凝血系统功能紊乱密切相关，可能是脓毒症患者发生DIC的重要机制。体外细胞实验研究显示，MASP-1可裂解凝血酶原，其裂解方式与FXa介导的凝血酶原裂解相似，是凝血酶的另一种活化形式，可使TAT生成增加[10]；并且MASP-1具有切割和激活纤维蛋白原和因子ⅩⅢ的能力，可以驱动交联纤维蛋白原的形成并使其稳定，加速血凝块形成[11]。本研究在临床研究中进一步探讨了脓毒症患者MASP-1对凝血系统的调节作用。ISTH评分是脓毒症凝血功能障碍的公认评分系统，但此评分系统有一定的局限性，因为血小板、纤维蛋白原和纤维蛋白降解产物都是急性反应物。为对凝血功能进行全面了解，本研究进一步测定了TAT血清水平。结果显示，DIC组和非DIC组的TAT水平明显高于对照组，说明脓毒症患者普遍存在血液高凝状态，凝血酶活性明显高于对照组；DIC组明显高于非DIC组，说明DIC患者血液高凝状态更加严重。DIC组MASP-1表达水平明显高于非DIC组，且两组均高于对照组。Spearman相关性分析显示，MASP-1与TAT呈正相关，TAT是凝血酶生成的分子标志物，说明MASP-1的激活增加与脓毒症的严重程度和凝血相关疾病密切相关，与Jenny等[5]研究中MASP-1可以增强微血管流动模型中的血凝块形成观点一致。因此，MASP-1可作为脓毒症相关凝血功能障碍发生和严重程度的潜在生物标志物，其临床实用性需进一步验证。

脓毒症时内皮细胞作为病原体及其毒素的靶细胞，易被过度活化的炎症介质损伤，同时抑制蛋白质C的激活和抗凝血酶的释放，导致机体内的凝血-抗凝系统失衡，增加了发生DIC的风险。TM和t-PAIC被认为是内皮细胞损伤的生物标志物，脓毒症合并DIC患者血浆中TM和t-PAIC水平升高已被证实[12]。Debreczeni等[13]研究显示，MASP-1可通过裂解蛋白酶激活的受体4激活内皮细胞，介导中性粒细胞和内皮细胞上的TF表达、激活的内皮细胞和血小板上P-选择素的暴露增加及内皮细胞分泌炎性因子，促进炎症反应，从而增强内皮损伤[14，15]。因此，MASP-1与脓毒症合并DIC患者的内皮损伤密切相关。本研究结果表明，DIC组TM、t-PAIC水平显著高于非DIC组，并且Spearman相关性分析显示，MASP-1与TM和t-PAIC水平分别呈正相关，TAT和t-PAIC作为内皮细胞损伤的生物标志物，说明MASP-1是脓毒症患者发生DIC的内皮细胞损伤的重要病理因素。采用ROC曲线评估MASP-1、TAT、TM和t-PAIC对脓毒症合并DIC的诊断效能，结果显示单独指标中TAT对脓毒症合并DIC的诊断性能最高（0.705），其次为MASP-1（0.695），t-PAIC的诊断效能最差（0.661）；MASP-1和TAT、TM、t-PAIC联合检测的曲线下面积最大（0.751），敏感度为51.0%，特异性为87.6%。说明脓毒症患者的补体蛋白MASP-1与DIC的发生发展密切相关。MASP-1作为脓毒症相关DIC治疗的生物标志物或靶标的潜力需在今后的研究中加以探讨。后续将扩大样本量，增加凝集素途径其他蛋白的临床研究以及更全方面的方法学来证实本研究观点。

综上所述，MASP-1与脓毒症患者凝血功能紊乱和内皮细胞损伤密切相关，为探讨脓毒症患者合并DIC的发生机制提供了新思路。ROC曲线显示MASP-1可作为脓毒症患者合并DIC的早期新型标志物，具有较理想的诊断价值；MASP-1联合血栓分子标志物对脓毒症合并DIC的诊断价值更高，可为临床早发现、早治疗及改善预后提供重要依据。