人工生产僵蚕菌种质量检验

孙 佩，叶 霄，童 文，龙燕梅，况再银

（四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所，成都 610300）

0 引言

僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx moriLinnaeus 4～5 龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌Beauveriabassiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥体[1]。具有息风止痉、祛风止痛、化痰散结功效，用于肝风夹痰、惊痫抽搐、小儿急惊等。僵蚕的传统主要来源是收集家蚕饲养过程中自然僵死的病蚕，由于养蚕技术的发展，自然僵蚕越来越少，产量和质量不稳定[2]，亟需开展人工生产僵蚕，保障僵蚕的药用需求。人工生产僵蚕需要把僵蚕菌种（即球孢白僵菌分生孢子）配制成一定浓度的悬浮液均匀喷在5 龄蚕体上，之后按常规方法饲养家蚕，并保持一定的温度、湿度，使分生孢子萌发侵入蚕体，导致家蚕在结茧前僵死，干燥后形成僵蚕药材[3]。

20世纪50年代末期，由中国药材公司投资在海南岛文昌县建立了全国第一间僵蚕厂[4]。江苏马山公社从1968 年开始人工培养白僵蚕[5]，试验了僵蚕的产量与白僵菌的分生孢子的毒力、数量和家蚕成僵率之间的关系。同时期，广东省药材部门在太湖马山公社和增城县石滩公社建立了僵蚕场[4]。此后，河南济源、甘肃兰州、福建晋江等地也先后建立僵蚕厂（场）进行人工培养白僵蚕。1982 年，王印安[6]报道了河南济源中药材试验场直接用鲜僵蚕制成孢子悬浮液进行喷雾接种生产僵蚕，接种量的大小根据家蚕对白僵菌抵抗力的强弱，菌株毒力的大小等情况灵活地掌握。这些养殖基地的白僵菌种的来源有2个途径。一是直接用新鲜僵蚕洗水，取其孢子液进行喷射蚕体接种（江苏的经验）；二是进行人工培养，从新鲜僵蚕体上分离球孢白僵菌，进行纯培养和扩大培养，选择取材方便、经济且适合白僵菌繁殖的培养基[4]。时至今日，人工僵蚕基地的蚕农依然采用自然僵蚕体表的白僵菌孢子进行僵蚕生产接种。蚕农自繁自留的自然僵蚕菌种未经过纯化和筛选，缺乏可参考的质量指标，使用多凭经验，导致人工僵蚕产量低，僵化差。

为了满足人工僵蚕生产需求，王更先[7]在PDA 培养基上培养9株白僵菌，15天后获取大量分生孢子，确定人工生产白僵蚕白僵菌的接种浓度应在1×107个/mL孢子以上。杨琼等[8]报道了僵蚕菌种筛选、最佳接种剂量、适宜蚕品种的研究，确定了最佳菌株、最佳接种浓度和适宜的蚕品种。邢东旭等[9]分离纯化到一株高致病力的白僵菌，并对接种该菌株生产僵蚕的药用品质进行评价。李文学等[10]从自然感病僵蚕上分离的致病菌株进行鉴定，并研究其人工饲养僵蚕的最适使用浓度。陈静等[11]用一株家蚕病原白僵菌在PDSA培养基生长和产孢，进行2 次中试人工生产白僵蚕。前人的研究使用的白僵菌种处于实验室平板培养阶段，未开展菌种（孢子粉）规模化扩繁和生产应用，未见僵蚕菌种质量检验方法或检验指标的报道。蚕农对优质僵蚕菌种有需求，而市场上流通的菌种（自然僵蚕孢子粉）缺少检验方法和质量评价指标，质量难以分辨。对于僵蚕人工生产，亟需质量稳定的僵蚕菌种和菌种质量检验方法，以保障人工接种生产僵蚕成功。

球孢白僵菌有3种形式的侵染体，即分生孢子、芽生孢子和菌丝。徐庆丰[12]等发现，白僵菌的气生分生孢子要比液生分生孢子耐贮，杀虫试验中液生分生孢子与固体分生孢子的效果相近或稍低，芽生孢子则毒力很低。骆家玉[13]采用玉米面、麦麸、水作培养液，麸皮、谷壳、大米作固体培养基开展了球孢白僵菌液固双相发酵的研究。张丽靖[14]以去掉琼脂的萨氏培养液作培养液，以低价质差釉稻米作固体培养基开展了球孢白僵菌液固双相发酵的研究。樊美珍等[15]经过比较，营养贫乏的PDA 培养基培养白僵菌容易产生变异，SDAY 培养白僵菌最稳定，且最适合白僵菌生长。本课题组前期筛选了优质球孢白僵菌株，并采用液固双相发酵法培养了高纯度的孢子粉。参考GB/T25864—2010《球孢白僵菌粉剂》[16]、NY/T2295.1—2012《真菌微生物农药球孢白僵菌第1部分：球孢白僵菌母药》[17]、SN/T 2374—2009《绿僵菌、白僵菌生物农药检验操作规程》[18]等标准中的菌种鉴别、含孢量、杂菌率等检验方法并加以改进，开展液固双相发酵法制备的僵蚕菌种和自然僵蚕菌种的质量检验，建立可靠的僵蚕菌种检验方法和质量评价指标，对人工僵蚕生产具有重要指导意义。

1 材料和方法

1.1 仪器及设备

Nikon80i 荧光显微镜、丹佛T-203 千分之一分析天平，搅拌器，血球计数板(25×16)，玻璃器皿等。

1.2 僵蚕菌种来源

本课题组前期从自然僵蚕中分离并筛选出1株优质球孢白僵菌株BJ-MJ，经18S rDNA/ITS序列分子鉴定，该菌与球孢白僵菌同源性均在99%，并结合其形态学特征，确定为球孢白僵菌。笔者参考相关文献[14]，改为用菌袋包装固体培养基（专利申请号：201910703859.1）进行液固双相发酵法培养BJ-MJ 菌株孢子粉。在实验室培养3批BJ-MJ菌孢子粉作为对照菌种，从云南和广西的人工僵蚕基地收集2 批自然僵蚕菌种，从网络购买1批僵蚕菌种，见表1。

表1 僵蚕菌种信息

1.3 僵蚕菌种检验方法

1.3.1 显微计数法测活孢数

（1）方法提要：标准GB/T25864—2010“孢子萌发率”和标准SN/T 2374—2009 中“活孢率”的测定是指萌发的孢子数占孢子总数的百分比。由于球孢白僵菌孢子很小（直径2～3 μm），受菌种制备条件影响，在显微镜下难以分辨孢子和其他杂质（培养料颗粒或蚕砂渣），孢子总数计数不准确会影响活孢率的计算结果。而萌发后的孢子在显微镜下形态清晰，进行萌发的孢子计数可操作性好且准确。本试验参考标准GB/T25864—2010“孢子萌发率”测定方法，将孢子粉用麦芽浸粉培养液稀释至适当倍数，经过摇床培养萌发后，在显微镜下用血球计数板计萌发孢子数作为活孢数。

（2）显微计数法测活孢数检验程序：用精度为千分之一的天平准确称取孢子粉1.00 g，装入盛有灭菌麦芽浸粉培养液（含2%麦芽浸粉和0.05%吐温80，用蒸馏水配制，在121℃条件下灭菌20 min）100 mL的三角瓶中，摇动三角瓶使孢子粉润湿后，用手持电动搅拌器搅拌1 min，即成为均匀的孢子母液。用无菌移液管吸取5.0 mL 上述母液，加至盛有灭菌麦芽浸粉培养液45 mL 的三角瓶中，按1→10 进行系列稀释（参照表2），分别得到不同稀释度孢子悬液（每个稀释度应更换无菌移液管）。

将0～4 号孢子悬液置于120 r/min 的摇床上，在26℃条件下培养16 h，取样制片镜检。选择孢子浓度在每中格20～40 个的稀释度用血球计数板计数，芽管大于孢子半径的萌发孢子计为活孢子。血球计数板计数格为25 个中格，16 个小格，则计算双线范围内4 个中格共64 个小格的孢子总数。计数时每中格的四周如有压线的孢子，计上线不计下线，计左线不计右线。按公式(1)计算待测样品的活孢子含量：

式中：S—活孢数，孢子/g；S1～S4—任意4个中格中萌发孢子的数量；T—为稀释倍数。

1.3.2 菌种鉴别 采用1.3.1 项下稀释涂布法将僵蚕菌种在1.3.3项下平板培养基上培养出菌落后，观察菌落形态学特征，在显微镜下根据产孢结构和分生孢子形态进行鉴别。球孢白僵菌形态特征为菌落绒状，丛卷毛状至粉状，有时呈绳束状，但很少形成束丝梗；白色，稍后或变成淡黄色，偶成淡红色；背面无色，或淡黄至粉红色。分生孢子梗多，着生在营养菌丝上，粗1～2 μm。产孢细胞（瓶梗）浓密簇生于菌丝、分生孢子梗或膨大的泡囊（柄细胞）上，球形至瓶形，颈部明显延长成粗1 μm、长达20 μm的产孢轴，轴上具小齿突，呈膝状弯曲（“之”字形弯曲）产孢细胞和泡囊常增生，在分生孢子梗或菌丝上聚成球形至卵形的相当密实的孢子头。分生孢子球形或近球形，透明，光滑，(2～3)×(2～2.5)μm[19]。

1.3.3 细菌、真菌杂菌、球孢白僵菌的平板菌落计数

（1）方法提要：参考NY/T 2295.1—2012，“杂菌率的测定”用营养琼脂(NA)培养基检测样品中的细菌杂菌。参考GB 20287—2006[20]“霉菌杂菌数的测定”用马丁培养基检测样品中的真菌杂菌，按照GB 20287—2006“有效活菌数的测定”进行菌落计数。将样品配制成不同梯度的孢子悬浮液，分别涂布在营养琼脂培养基和马丁培养基平板上，利用细菌生长快于真菌的特点，在24～48 h 时，对适宜浓度的NA 平板上长出的细菌菌落进行计数；在72～96 h时，对适宜浓度的马丁平板上长出球孢白僵菌和真菌杂菌分别计数。根据代表性菌落的产孢结构，参照1.3.2项下方法进行白僵菌鉴定。

（2）平板菌落计数检验程序：用精度为千分之一的天平准确称取孢子粉1.00 g，装入盛有含0.05%吐温80 的灭菌水100 mL 的三角瓶中，用手持电动搅拌器搅拌1 min，即成为均匀的孢子母悬液。参照表2进行梯度稀释，稀释液为含0.05%吐温80 的灭菌水，得到不同稀释度孢子悬液。

表2 梯度稀释示例

每个样品取3 个连续适宜的稀释度，用微量移液器吸取不同稀释度孢子悬液0.1 mL，分别加至预先制备好的营养琼脂和马丁培养基平板上，用曲玻棒涂布均匀，每一稀释度重复3次，同时以含0.05%吐温80的灭菌水作空白对照，在26℃条件下培养。

根据菌落特征，营养琼脂平板在培养24～48 h 时进行细菌杂菌计数，马丁培养基平板在培养72～96 h时进行真菌杂菌和球孢白僵菌分别计数，以出现20～300个菌落数的稀释度的平板为计数标准。当只有一个稀释度，其平均菌落数在20～300 个之间时，则以该平均菌落数计算。若有两个稀释度，其平均菌落数在20～300个之间时，应按两者菌落总数之比值决定。若其比值≤2应计算两者的平均数；若＞2则以稀释度小的菌落平均数计算。

式中：N-每克样品中的菌落数(CFU/g)；S1～S3—符合计数标准的稀释度的3 个平板菌落数；T—为稀释倍数；M—样品量，单位为克。

2 结果与分析

2.1 显微计数萌发孢子检验结果

经过16 h培养，1号孢子悬液适合镜检计数，见图1。由图1可知，BJ-MJ-1孢子萌发数量多，且孢子两端萌发菌丝长，无其他杂菌菌体。WG 萌发孢子数量少且菌丝短（活力差）。YN 和GX 萌发孢子数量少且菌丝短，其他杂菌（杆状细菌等）多，背景浑浊。显微计数法测活孢数结果见表3，3批采用液固双相发酵培养的孢子粉，萌发孢子数最高（＞3.3×1010孢子/g），自然僵蚕孢子萌发数较低（3.7×109～1.4×1010孢子/g）。

图1 显微镜下示孢子萌发

2.2 菌种鉴别与平板菌落计数结果

2.2.1 菌种鉴别 在马丁培养基上，球孢白僵菌落经过96 h 培养呈绒毛状，144 h 后产孢后菌落呈粉状，见图2。选择各样品中稀释度适宜，杂菌稀少的平板，挑起典型的白色菌落，观察产孢细胞和分生孢子形态，均符合“1.3.2”描述，经形态鉴别判定为球孢白僵菌。

图2 BJ-MJ-1在马丁培养基形态

2.2.2 平板活孢和真菌杂菌计数 经过96 h培养，选择适宜稀释度的马丁平板进行真菌杂菌计数，选择稀释度5～6 号的马丁平板进行活孢（白僵菌落）计数，结果见表3。由图可知，经液固双相发酵培养BJ-MJ-1全部为白色白僵菌菌落（无其他真菌杂菌），WG 中黑色和白色真菌杂菌数量多，YN 中有绿色霉菌，GX 中有白色真菌杂菌。除“BJ-MJ-3”的1 号稀释度平板长出杂菌外，其他液固双相发酵孢子粉样品在1号稀释度平板均未检出真菌杂菌，真菌杂菌数表示为＜104CFU/g。

2.2.3 细菌平板计数 经过48 h培养，选择适宜的营养琼脂平板进行细菌计数，计数结果见表3。图5 为3 号稀释度的平板培养96 h 白僵菌落长出时拍摄。由图3 可知，经液固双相发酵培养的BJ-MJ-1 全部为白色白僵菌菌落（无细菌），WG、YN、GX 中细菌数量多，长满平板。液固双相发酵孢子粉3批样品在1号稀释度平板均未发现细菌杂菌，细菌杂菌数表示为＜104CFU/g。

图3 产孢结构

表3 僵蚕菌种活孢数和杂菌检验结果

图5 营养琼脂培养基示细菌杂菌

图4 马丁培养基示真菌杂菌

3 结论与讨论

目前生产中使用的自然僵蚕筛分获得的蚕体孢子粉，蚕农凭经验用量为15～35 g，由于含孢量低并且用量不准确，导致蚕僵死率低。此外，自然僵蚕在开放的环境僵化和产孢，常遭环境中其他微生物污染，蚕体还可携带上一批养殖的细菌类蚕病，接种家蚕后产生脓蚕，造成养殖损失。且不同季节僵蚕僵化的环境条件变化，蚕体孢子质量极不稳定。本试验结果表明，3批采用液固双相发酵培养的孢子粉，萌发孢子数＞3.3×1010孢子/g，平板活孢数＞1010CFU/g，真菌杂菌数＜104CFU/g，细菌杂菌数＜104CFU/g。自然僵蚕孢子萌发数较低（3.7×109～5.9×109孢子/g），平板活孢数较低(1.5×109～1.8×1010)，真菌杂菌＞105CFU/g，细菌数量＞108CFU/g。为了保证人工僵蚕接种成功，建议僵蚕人工养殖采用液固双相发酵法制备的球孢白僵菌孢子粉，规定液固双相发酵法制备的僵蚕菌种（孢子粉）质量指标活孢数（显微计数萌发孢子或平板活孢数）≥1010孢子/g，真菌杂菌数的含量＜105CFU/g，细菌杂菌数的含量＜105CFU/g。

笔者参考文献[7-8]进行了生产试验，接种家蚕需要的孢子悬浮液浓度为107孢子/mL，与文献报道一致，但文献均未报道孢子粉具体用量。本课题组采用液固双相发酵法培养的孢子粉，含量高于1010孢子/g，萌发好，经过不同季节、不同蚕种生产试验，确定每张蚕种（约3 万头）养至5 龄起蚕接种孢子粉用量只需1.5～2.0 g，具有良好的经济效益。

由于人工僵蚕基地的菌种通常来源于自然僵蚕，采用形态学特征进行菌种鉴定快速且容易操作，通常情况下已够用。但形态特征常会因营养条件和寄主的不同而发生变异[21]，分子标记技术在白僵菌鉴定研究中应用普遍[22]，在有争议的情况下，可参考SN/T 2374—2009中附录B，采用18S rDNA/ITS序列进行白僵菌分子鉴定。

在高温和高湿的条件下孢子粉极易失活，故孢子粉一般采用低温低湿避光保存，常温贮存不超过半年[16]。由于家蚕养殖具有稳定的季节性，建议孢子粉培养根据僵蚕生产计划临用前制备，克服孢子粉不耐储存的缺陷。由于孢子粉具有疏水性，直接加入水中会漂浮表面，僵蚕生产接种用孢子悬浮液需搅拌机搅匀或者装入瓶中振摇混悬，需进一步开展孢子粉可湿性粉剂的配方研究，为人工僵蚕生产提供使用方便、质量好的菌种。