马钱苷对裸鼠体内结肠癌的抑制作用及其机制研究

周永静，王肖辉，李如意，周霖▲，吴慧丽▲

(1.郑州大学附属郑州中心医院，河南 郑州 450007；2.郑州市中心医院，河南 郑州 450007；3.郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052；4.上海市闵行区梅陇社区卫生服务中心，上海 中国 201104)

结肠癌是当前临床较为常见的消化系统肿瘤，其发生率及死亡率一直居于全球恶性肿瘤前列[1,2]。截止目前，该病的病因及病机仍不明确，临床常采用的化疗及根治术虽然在一定程度上降低了肿瘤的死亡率，且明显改善病人预后，然而这些手段在疾病治疗过程中对多数患者的正常脏器会产生较大的损伤，严重影响患者的生活质量和预后水平[3-5]。中医药是中国传统文化的瑰宝，随着传统医学的不断发展和进步，中医药对于肿瘤的防治已经取得明显成效。研究表明，中药的某些化学成分能够显著抑制肿瘤生长，且具有高效低毒，综合调节等显著优势，近年来得到广大学者和临床专家的一致认可，这些中药活性成分可能是未来肿瘤治疗的潜在靶点药物[6,7]。

马钱子，为马钱科植物马钱的干燥成熟种子，具有散结消肿，通络止痛的功效，主治跌打损伤，骨折肿痛，痈疽疮毒等。马钱苷(Loganin,Log)是从金银花、山茱萸和马钱子中提取的环烯醚萜苷，具有显著的免疫调节及抗炎等作用[8]。肿瘤的发生发展与机体免疫密切相关，近年来，关于马钱苷的抗肿瘤活性引起广泛关注[9-12]，但目前马钱苷对结肠癌的治疗作用还未见报道。因此，本实验通过SW480细胞接种BALB/c裸鼠，观察和探讨马钱苷对结肠癌裸鼠的干预作用，为马钱苷治疗结肠癌的作用机制提供重要的理论依据。

1 实验材料

1.1 药物和试剂

马钱苷(10 mg，批号：18524-94-2，sigma公司)；5-氟尿嘧啶(5-Fu，1 g，批号：51-21-8，LMAI Bio公司);白细胞介素-6(IL-6)(96T，批号：E-EL-M0044c，Elabscience公司)；白细胞介素-1β(IL-1β)(96T，批号：E-EL-M0037c，Elabscience公司)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(96T，批号：E-EL-M0049c，Elabscience公司)；超氧化歧化酶(SOD)(50T/48样，批号：A001-1，南京建成生物有限公司)；过氧化氢酶(CAT)(50T/48样，批号：A007-1，南京建成生物有限公司)；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)(50T/24样，批号：A005-1，南京建成生物有限公司)；与丙二醛(MDA)(50T/48样，批号：A003-1，南京建成生物有限公司)；Nrf-2(20 μL，批号：12721T，Cell Signaling Technology公司)；HO-1(100 μL，批号：868065，Cell Signaling Technology公司)；RhoA(20 μL，批号：2117T，Cell Signaling Technology公司)；ROCK1(20 μL，批号：40035T，Cell Signaling Technology公司)；ROCK2(100 μL，批号：82365，Cell Signaling Technology公司)；p-NF-kBp65(20 μL，批号：3033T，Cell Signaling Technology公司)；NF-kBp65(20 μL，批号：6956T，Cell Signaling Technology公司)；GAPDH(100 μL，批号：51332S，Cell Signaling Technology公司)。

1.2 动物

BALB/c裸鼠(8周，20～22 g)购自郑州大学动物中心，饲养在(23±2)℃的SPF动物房中，光照/黑暗周期为12 h，自由饮水和食物。

1.3 动物伦理

所有动物实验均按照郑州大学动物伦理委员会操作指南进行。

1.4 细胞系和细胞培养

SW 480购自于美国细胞中心，SW 480细胞培养在10%胎牛血清的MEM培养基。所有培养基都保存在37℃的5%的CO2培养箱中。

2 实验方法

2.1 动物建模和分组给药

将SW480细胞悬液(每只裸鼠3×106细胞，0.2 mL)皮下注射到裸鼠的左腋窝，并接种40只裸鼠。接种SW480细胞的裸鼠7 d后均出现直径约5 mm的皮下结节，成功建立移植瘤模型。接种后第8天，将已建立皮下移植肿瘤模型的30只裸鼠随机分为3组(n=10)：模型组(M)、马钱苷组(Log组)(5 mg/kg)、5氟尿嘧啶组(5-Fu组)(20 mg/kg)，马钱苷及5-Fu均溶于含NaOH的生理盐水中,腹腔注射相应药物，0.1 mL/只裸鼠。模型组给予等量生理盐水，每隔2 d 1次，连续7次。

2.2 裸鼠体质量与肿瘤体积测定

每3 d记录裸鼠体质量，每隔3 d测量1次肿瘤裸鼠的体质量、最大直径(a)和最小直径(b)，并根据公式计算肿瘤体积:v=ab2/2(mm3)。

2.3 肿瘤组织学分析

最后一次给药后24 h时,立即切除肿瘤组织，固定在4%多聚甲醛溶液中，石蜡包埋并切成 5 μm厚度。石蜡切片在二甲苯和乙醇中脱蜡，用苏木精和伊红染色，然后在200倍放大的光学显微镜下观察。

2.4 血清和细胞上清液中炎症细胞因子水平的测定

血清和细胞上清液中的白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平通过ELISA试剂盒根据制造商的说明进行测定。

2.5 血清与肿瘤组织氧化应激指标检测

血清和细胞上清液中的超氧化歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)、与丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的水平通过商品化试剂盒进行测定。

2.6 免疫组织化学染色

免疫组织化学染色检测肿瘤组织中Nrf-2、ROCK1和p-NF-kBp65的表达水平。具体过程为，肿瘤组织用4%多聚甲醛(PFA)固定，包埋在石蜡中并切片。石蜡切片在二甲苯和乙醇中脱蜡，在柠檬酸钠缓冲液中微波处理，并用PBS洗涤。内源过氧化物酶活性被3%的过氧化氢阻断20 min。每个样品用5%山羊血清封闭20 min，然后用一抗抗体在4℃处理过夜。第2天，用PBS洗涤3次后，将每个样品用山羊抗兔IgG二抗处理20 min，然后孵育辣根过氧化物酶标记的链霉菌抗生物素蛋白工作液(Streptavidin-perosidase,SP)20 min，用PBS洗涤3次。然后，样品用3-3′二氨基联苯胺(DAB)染色，并用苏木精重新染色。脱水和干燥后，切片用中性树胶固定并在显微镜下观察。

2.7 蛋白质印迹

将样品切碎并在含有2 mmol/L PMSF的冰冷RIPA缓冲液中提取蛋白。然后样品在4℃下于12 000×g离心15 min，总蛋白浓度通过BCA分析试剂盒测定。将蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脱脂奶粉封闭2 h，然后在4℃下用孵育一抗过夜。第2天，用辣根过氧化物酶偶联二抗孵育2 h，膜通过增强化学发光(Enhanced Chemiluminescence,ECL)试剂显影并进行凝胶成像系统成像。

2.8 统计分析

所有数据均以表示，并使用GraphPad软件绘图(Version 6.0，Graphpad Prism Software)。通过单因素方差分析和图基多重比较检验分析各组均值差异的统计显著性。两组之间统计学比较，采用t检验，P值小于0.05被认为具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 Log对荷瘤裸鼠肿瘤重量和肿瘤体积的影响

结果显示：Log组的肿瘤重量和肿瘤体积低于模型组(P<0.01)，见图1。

注：与模型组比较：##P<0.01

3.2 Log对荷瘤裸鼠血清和肿瘤中促炎细胞因子的影响

如图2所示，与模型组相比，Log增高了荷瘤裸鼠血清和肿瘤中促炎细胞因子水平(P<0.01)，这一结果表明，Log能提高荷瘤裸鼠的T细胞免疫功能。

注：与模型组比较：##P<0.01

3.3 Log对荷瘤裸鼠血清和肿瘤中氧化应激指标的影响

如图3所示，与模型组相比，Log提高了荷瘤裸鼠血清和肿瘤中MDA水平，降低血清与肿瘤组织中SOD、CAT、GSH-Px水平。这一结果表明，Log能调节荷瘤裸鼠的氧化应激水平。

注：与模型组比较：##P<0.01

3.4 Log对荷瘤裸鼠肿瘤组织Nrf-2、ROCK1和p-NF-kBp65蛋白的影响

如图4所示，免疫组织结果显示，与模型组相比，Log提高了荷瘤裸鼠肿瘤中ROCK1、p-NF-kB p65的水平，同时降低了肿瘤组织Nrf-2水平(P<0.01)。

注：与模型组比较：##P<0.01

3.5 Log对荷瘤裸鼠肿瘤组织Nrf-2/NO-1信号与ROCK/NF-kB信号蛋白水平的影响

如图5蛋白印迹结果显示，与模型组相比，Log提高了荷瘤裸鼠肿瘤中RhoA、ROCK1、ROCK2、p-NF-kBp65的水平，同时降低了肿瘤组织Nrf-2、HO-1水平(P<0.01)。

注：与模型组比较：##P<0.01

4 讨论

有研究表明马钱子具有抗肿瘤的效果，马钱子的主要成分马钱苷可以抑制癌细胞增殖和迁移[13]。本研究表明，马钱苷可以减小肿瘤体积，调节荷瘤裸鼠体内氧化应激、炎性反应，其机制可能与Nrf-2/NO-1信号与ROCK/NF-kB信号的调控有关。

结肠癌是中国最常见的消化系统疾病之一。各种炎性刺激因子可在肠粘膜下层聚集大量巨噬细胞，并激活巨噬细胞分泌各种促炎因子。炎症因子进一步诱导肠上皮细胞凋亡和坏死，这是结肠癌的主要机制之一。近年来，我国结肠癌的治疗取得了很大进展，但多重耐药问题日益严重[14]。尽管目前大量结肠癌患者受益于新辅助化疗，但在同步化疗和放疗的情况下，结肠癌的存活率仍然很低[15]。据报道，化疗耐药性是结肠癌患者治疗失败的常见原因。

炎性反应是指免疫反应的激活，在此期间炎性细胞因子过度产生，包括IL-6和TNF-α[16]，与结肠癌相关的炎性细胞因子产生增加[17]。据报道，肿瘤组织中TNF-α水平的升高与结肠癌的严重程度相关，并且IL-1β的产生对某些信号通路产生不利影响[18]。此外，各种肿瘤组织中循环水平的IL-6的增加，被认为是结肠癌进展的预测因子[19]。研究表明，结肠癌降低了炎性细胞因子的表达，其表现为血清和细胞中IL-1β、TNF-α和IL-6水平的降低，提示结肠癌存在免疫抑制，且与患者预后不良有关[20]。而Log可明显提高体内外IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。

众所周知，抗氧化剂/II相解毒酶的丧失加上活性氧和氮的增加，对正常的结肠稳态是有害的。先前的研究表明，抗氧化剂/II相解毒酶表达的减少有助于解释Nrf2基因敲除小鼠更易受直接应激反应诱导的结肠疾病的影响[21]。目前的研究还表明，一些抗氧化剂/II相解毒酶的表达，包括NAD(P)氢醌还原酶1和UDP-葡萄糖醛酸基转移酶1A1，在用氮氧甲烷/DSS处理的小鼠的正常粘膜中升高，但未敲除Nrf2。血红素加氧酶1在经处理的WT和Nrf2敲除小鼠的正常粘膜中的表达增加。在Nrf2敲除小鼠中诱导血红素加氧酶1不足为奇，因为调节血红素加氧酶1的其他转录因子(除Nrf2外)，如缺氧诱导因子1[22]和激活蛋白1[18]，可能仍存在于Nrf2敲除小鼠中。总之，这些数据表明解毒酶NAD(P)H-醌还原酶1和UDP-葡糖醛酸基转移酶1A1的表达降低，可能是加速Nrf2基因敲除小鼠结肠组织中肿瘤转化的重要事件，进一步表明这些防御酶对于保护结肠粘膜免受结肠相关结肠直肠癌形成是重要的。本文研究发现，Log显著荷瘤裸鼠减低Nrf-2、HO-1蛋白表达。表明Log可以调控荷瘤裸鼠体内氧化应激。

先前的研究表明，氧化应激失衡可以促发炎症信号的表达。生物体细胞在遇到种种应激刺激时，机体内产生高水平高活性物质，如活性氧、氮自由基等，从而导致机体内氧化-还原反应速率失衡，而各种氧化物导致的一体化氧化速度超出了机体抗氧化能力，最终结果导致氧化应激损伤人体组织。氧化应激的本质即体内氧化-抗氧化系统的失衡[23]。同时，生物体在长期的进化过程中，也相应形成了一套有效的自由基清除机制。这些抗氧化的酶包括SOD和GSH-Px等，一般来说，在肿瘤早期，因为自由基水平大大增加，这些过氧化物酶(SOD和GSH-Px)含量是明显降低的；而MDA是机体内不饱和脂肪酸在自由基的作用下产生脂质过氧化的最终产物，是反映体内氧化应激水平的一项重要指标，在肿瘤发展早期时表现为水平升高[24-25]。本研究结果显示，马钱苷最终降低SOD和GSH-Px水平，升高MDA水平，可能是由于马钱苷在肿瘤发展后期，激活体内炎症因子水平，激活肿瘤炎性反应，促进肿瘤细胞凋亡，从而导致体内的SOD和GSH-Px水平被动降低，MDA水平相应升高的现象[26]。

结肠癌已经发现慢性和反复炎症，氧化应激失衡不仅释放反应性炎症刺激，而且诱导多种炎症介质[27,28]，包括白介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白介素-6和TGF-β的表达增加有关增加。除此之外，氧化应激失衡可以激活ROCK信号，激活的ROCK信号可以进一步下游NF-kB信号。本实验发现，Log可以显著增加RhoA、ROCK1、ROCK2、p-NF-kBp65蛋白表达，增加肿瘤炎症反应，导致肿瘤细胞凋亡。

总之，本研究阐明了Log在结肠癌调节中的作用，Log有效地增加了结肠癌裸鼠的炎症，增强了体内氧化应激失衡，本实验证明了Log通过下调Nrf-2/NO-1及上调ROCK/NF-kB蛋白信号是其治疗结肠癌的可能潜在作用机制，为将来更深层次的研究奠定了科学的前期基础。