大黄素调控NLRP3/Caspase-1信号通路对实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠的免疫调节作用*

南晓晶, 杨舒炜

浙江中医药大学附属第三医院 1检验科， 2内分泌科(浙江杭州 310009)

自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)是器官特异性自身免疫疾病，在临床上较为常见，临床主要表现为咽部不适、吞咽困难、颈部压缩等症状，且甲状腺淋巴细胞的浸润程度不同可导致甲状腺功能丧失与萎缩，且该病的发病率受多种因素的影响逐年增加，故寻找该病有效的治疗方式相当重要[1-2]。实验性自身免疫性甲状腺炎(experimental autoimmune thyroiditis，EAT)的动物模型病理基础与临床表现与人类AIT相同，主要用于AIT研究[3-4]。大黄素为蒽醌类衍生物，是中药大黄茎与干燥根中的有效成分，具有免疫抑制的作用。含有pyrin结构域的蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)在疾病的发生中具有重要作用，NLRP3/Caspase-1可通过破坏环境刺激物、晶体物质与病原微生物所激活，参与AIT的发病机制与机体免疫，有研究显示，NLRP3通路的激活与AIT相关。基于上述背景，积极寻找此病的发生机制对临床上治疗的研究具有重要的意义。2020年6—12月，本研究分析大黄素调控NLRP3/Caspase-1通路对EAT大鼠的免疫调节作用，以明确大黄素与EAT大鼠的关系，为临床上AIT的诊治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 选取SPF级6～8周龄SD大鼠60只，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(湘)2019-0014，体重(221.05±22.61)g，在相对湿度为29%～35%、温度为21～24℃下饲养1周，每天光照24 h，明暗周期为12 h。本实验操作均严格参照动物实验伦理要求相关规定进行，且获得我院医学伦理委员会审批同意(ZSLL-KY-2021-036-01)。

1.2 方法

1.2.1 分组与建模 60只中选取12只作为对照组，其余48只大鼠参照侯丽萍等[6]报道的EAT的建立方法构建模型，将10 mg pTG(美国Sigma公司)与5 mL PBS进行融合，并与5 mL CFA(美国Sigma公司)进行混合，乳化后制作抗原含量为1 g/L的pTG乳化剂，将乳化剂按照1 mL/kg体重注射于对48只大鼠足垫及背部皮下，每周注射1次，连续注射2周，此为初次免疫，2周后为加强免疫，将pTG与IFA(美国Sigma公司)混合、乳化制成乳化剂备用，按照1 mL/kg体重注射于大鼠皮下多点，每周注射1次，连续注射4周，大鼠造模期间注意避光，饮用0.05%碘化钾水。加强免疫后2周，取1只建模大鼠的眶静脉血，检测TPOAb水平，TPOAb滴度≥60 IU/mL为建模成功，建模成功后大鼠死亡8只，将剩余40只大鼠随机分为模型组、大黄素低剂量组、大黄素中剂量组、大黄素高剂量组各10只。

1.2.2 给药干预 建模成功后，开始给药。对照组模型组与给予5 mg/kg生理盐水进行灌胃，大黄素低剂量组给予生理盐水+15 mg/kg大黄素，大黄素中剂量组给予生理盐水+75 mg/kg大黄素，大黄素高剂量组给予生理盐水+150 mg/kg大黄素。连续灌胃4周。

1.3 指标观察

1.3.1 样本采集 采集大鼠眶静脉血4 mL，以离心半径5 cm、3 000 r/min离心处理10 min，分离上层血清，分离大鼠颈部皮肤及肌肉层，显露出甲状腺软骨侧后方两叶甲状腺，取出气管与甲状腺，使用冷生理盐水进行冲洗，并吸干。

1.3.2 病理组织学观察 获取大鼠甲状腺组织进行切片、脱蜡、脱水操作，并使用HE进行染色，使用光学显微镜观察其改变。

1.3.3 甲状腺球蛋白抗体(TgAb)、白细胞介素-4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)检测 在用药结束后抽取眶静脉血4 mL，以离心半径5 cm、3 000 r/min离心处理10 min，分离上层血清，-80℃保存待检。采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测 TgAb、IL-4、IFN-γ水平，TgAb、IL-4、IFN-γELISA试剂盒由滁州仕诺达生物科技有限公司提供。货号为SND-R423。

1.3.4 外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+检测 抽取各组大鼠眶静脉血4 mL，制作单细胞悬液，加入抗体与溶血素反应10 min，以离心半径5 cm、3 000 r/min离心处理10 min，分离上层血清，并加入PBS进行清洗，采用流式细胞仪检测CD3+CD4+、CD3+CD8+变化。

1.3.5 NLRP3/Caspase-1通路蛋白检测 采集大鼠甲状腺细胞，冰上溶解25 min，加入细胞裂解液提取总蛋白，使用BCA试剂盒检测NLRP3、ASC、Caspase-1等蛋白含量，提取等量蛋白质，然后100℃变性5 min，使用凝胶电泳分离，4℃条件下加入一抗孵育过夜，洗涤15 min×3次，加入稀释好的二抗，孵育2 h，洗涤15 min×3次，定量分析蛋白表达情况。以GAPDH作为内参。

2 结果

2.1 组织学观察 对照组甲状腺滤泡大小均匀一致，滤泡细胞呈单层立方形或高柱形。模型组甲状腺滤泡结构紊乱，上皮细胞变扁，间质减少，明显淋巴细胞浸润。大黄素组甲状腺滤泡大小不一，少量淋巴细胞浸润。见图1。

注：A:对照组; B:模型组; C:大黄素低剂量组; D:大黄素中剂量组; E:大黄素高剂量组

2.2 各组TgAb、IL-4、IFN-γ对比 与对照组相比，其他4组TgAb、IL-4、IFN-γ水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，大黄素低、中、高剂量组TgAb、IL-4、IFN-γ水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；而大黄素中剂量组TgAb、IL-4、IFN-γ水平低于大黄素低、高剂量组，比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组TgAb、IL-4、IFN-γ对比

2.3 各组外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+对比 与对照组相比，其他4组CD3+CD4+、CD3+CD8+水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，大黄素低、中、高剂量组CD3+CD4+、CD3+CD8+水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；而大黄素中剂量组CD3+CD4+、CD3+CD8+水平低于大黄素低、高剂量组，比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.4 各组NLRP3/Caspase-1信号通路蛋白表达量对比 与对照组相比，其他4组NLRP3、ASC、Caspase-1水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，大黄素低、中、高剂量组NLRP3、ASC、Caspase-1水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；大黄素中剂量组NLRP3、ASC、Caspase-1水平低于大黄素低、高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3、图2。

表2 外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+对比

表3 各组NLRP3/Caspase-1信号通路蛋白表达量对比

图2 NLRP3/Caspase-1通路蛋白WB图

3 讨论

甲状腺由滤泡上皮细胞组成，为人体内分泌器官，可调节机体平衡与合成甲状腺激素[7-8]。AIT是由机体异常识别自身抗原使淋巴细胞侵入甲状腺组织，使其受损，AIT的发生多受环境与遗传影响，发病机制不明确，临床上AIT的治疗多使用中医药、局部免疫调节及硒，但其毒性、不良反应与复发可抑制AIT的治疗，故临床上寻找治疗此病的药物十分重要[9-10]。

大黄素又称朱砂莲甲素，从大黄根茎中提取[11]。研究显示[12-13]，大黄素具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、降血脂与调节免疫的作用，其免疫保护作用通过调节T淋巴细胞之间的平衡发挥作用，大黄素通过抑制树突状细胞的成熟与淋巴结的活化调节免疫抑制。本研究显示，不同剂量大黄素可降低EAT大鼠中的表达水平，表明大黄素对EAT大鼠具有保护作用。

CD4+CD8+细胞为人体重要的免疫细胞，CD4+主要表达于辅助T细胞，是Th细胞TCR识别的抗原共同体，参与Th细胞TCR识别的信号转导[14]。CD8+表达于细胞毒性T细胞，通过表面的MHC Ⅰ类分子与其他免疫细胞MHC Ⅱ类分子相结合，识别其他免疫细胞抗原分子[15]。临床研究显示，机体的免疫保护作用主要通过大黄素调节T淋巴细胞之间的平衡、分化能力发挥，且大黄素可通过调节CD4+/CD8+之间平衡抑制Th1/Th2分化而维持细胞免疫与体液免疫的正常功能，Th1介导细胞免疫主要通过分泌IFN-γ等细胞因子进行[16]。临床研究表明[17-18]，IFN-γ为促炎因子，可使B细胞进行分化，诱导其成熟，并促进B细胞记忆，且IFN-γ还可使甲状腺上皮细胞HLA-Ⅱ类抗原表达增强，激活大量单核细胞，使其进入甲状腺内，并使细胞毒性增强。Th2介导体液免疫通过分泌IL-4等抗炎细胞因子进行，可使机体的免疫应答受到抑制，且抗炎因子存在于甲状腺组织浸润的单核细胞中，其EAT免疫病情的进展可使抗炎因子表达降低[19]。本研究显示，EAT大鼠中IFN-γ、IL-4表达升高，大黄素可降低IFN-γ、IL-4在EAT大鼠的表达含量，且中剂量大黄素对IFN-γ、IL-4的降低水平高于低剂量与高剂量大黄素，表明大黄素可保护其EAT大鼠免疫功能，并使Th的细胞因子分泌及分化受到抑制，减轻EAT大鼠的炎症反应。

NLRP3为胞质内的模式识别受体，可与ASC形成炎性小体，使Caspase-1活化，NLRP3通过激活Caspase-1促使IL-1β形成活性细胞因子，此在先天免疫中起到关键作用，NLRP3炎性小体由NLRP3、ASC、Caspase-1组成，在AIT中发挥着重要作用[20]。研究表明[21]，免疫细胞通过NLRP3/Caspase-1参加先天免疫应答，且NLRP3在AIM2介导的甲状腺滤泡细胞与AIT相关。在本研究中，NLRP3、ASC、Caspase-1在EAT大鼠中表达升高，对大鼠使用大黄素后NLRP3、ASC、Caspase-1表达降低，且中剂量大黄素对NLRP3、ASC、Caspase-1的降低水平更为显著，表明大黄素可通过调节NLRP3/Caspase-1通路改善EAT。

虽然本研究认为大黄素具有改善EAT的作用，作用机制可能与NLRP3/Caspase-1通路有关，但此仅为本研究初步结果，临床并未有研究分析其关系，因此本研究上述实验结果还需后续研究进一步探讨验证，为EAT的研究提供新的方向。

综上所述，本研究发现，在对EAT大鼠做大黄素干预后，病变明显被抑制，其作用机制可能与大鼠的NLRP3/Caspase-1失活相关。

利益相关声明：所有作者均声明不存在任何利益冲突。

作者贡献说明：南晓晶、杨舒炜：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写，提出研究思路，分析试验数据，论文审核;杨舒炜：资料搜集整理，论文修改，进行统计学分析。