精料补饲水平对暖季放牧牦牛瘤胃发酵和菌群结构的影响

戴东文 ，庞凯悦 ，王迅 ，杨英魁 ，柴沙驼 *，王书祥 *

（1. 青海大学畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016；2. 青海省高原放牧家畜营养与饲料科学重点实验室，青海 西宁 810016；3. 青海省牦牛工程技术研究中心，青海 西宁 810016）

牦牛主要栖息在青藏高原及周围地区，是青藏高原的优势畜种，也是当地牧民重要的生产生活资料［1］。由于青藏高原独特的地理环境，一年只有“冷季”与“暖季”之分，与冷季相比，暖季牧草产量与营养成分虽然有所提高，但是仍不能满足牦牛高效生产的需要，传统放牧条件下生长效率较低［2-3］。瘤胃是反刍动物消化日粮的重要场所，其含有丰富的细菌、真菌、原虫等微生物。瘤胃微生物在蛋白质、碳水化合物和淀粉等营养物质消化中发挥重要作用，通过厌氧发酵产生挥发性脂肪酸和微生物蛋白，为宿主提供能量和蛋白质［4-5］。影响反刍动物发酵的因素有很多，其中饲粮精料水平是其中一个重要的因素。杨硕等［6］研究发现，补饲精料降低了大青山绒山羊瘤胃内与纤维分解相关细菌的丰度，而提高了产甲烷菌丰度。有研究表明，随着精料水平的提高，奶牛瘤胃中纤维降解菌的生长受到抑制，而产酸菌的丰度增加［7］。因此，适宜的精料补饲水平能够优化反刍动物瘤胃微生物区系，提高饲料利用率及动物的生产性能。本课题前期研究了精料水平对暖季放牧牦牛生长的影响，结果发现，暖季放牧牦牛饲喂较高精料水平时可获得较好的生长性能和养殖收益［8］，这可能与不同精料补饲水平影响了牦牛瘤胃菌群组成与结构有关，因此，本试验通过16s rDNA 高通量测序技术来探讨不同精料补饲水平对暖季放牧牦牛瘤胃菌群的影响，以期为青藏高原暖季放牧牦牛精准补饲提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

试验于2019年7-9月在青海省贵南县老扎西牧场进行，该草场属于高寒草甸草地，优势种有小嵩草（Kobresia humilis）、高山嵩草（Kobresia pygmaea）、矮嵩草（Kobresia humilis）、线叶嵩草（Kobresia capillifolia）等。选取健康、体况良好和体重相近（123.96±7.43）kg 的公牦牛48 头，随机分为4 组（每组12 头）：对照组（放牧）、补饲组每头分别补饲0.5（Ⅰ）、1.5（Ⅱ）和2.5 kg·d-1（Ⅲ）精料。试验期为70 d，其中预试期10 d，正式期60 d。

1.2 饲养管理与日粮成分

所有试验牦牛在同一草场放牧，设置4个面积大小一样的围栏小区，8：00 出牧，18：00 收牧，3个补饲组在出牧前和收牧后分两次进行补饲，所有试验牦牛自由饮水。补饲精料参照肉牛饲养标准（NY/T815-2004），结合放牧牦牛采食量配制［9］。牧草营养水平、精料组成以及精料营养水平见表1。

表1 牧草营养水平、精料组成以及精料营养水平（干物质基础）Table 1 Nutrient level of the pasture，ingredient and nutrient level of the concentrate supplement（DM basis）（%）

1.3 瘤胃液的采集

正式试验第60 天，晨饲前采用胃管式采样器（GCYQ-1-A，武汉市科立博器材有限公司）采集瘤胃液150 mL，4 层纱布过滤后立即测定pH 值，剩余瘤胃液样品分装至15 mL 离心管中，立即储存到液氮中，带回实验室备用。

1.4 指标测定与方法

1.4.1 瘤胃发酵参数的测定 pH：使用台式酸度计（HANNA HI221，北京菁美瑞科技有限公司）测定瘤胃液pH，测定前对该酸度计使用相应标准液进行校正；参照冯宗慈等［10］改进的比色法测定瘤胃液氨态氮（NH3-N）浓度，仪器为紫外可见分光光度计（TU-1810，北京普析通用仪器有限公司），预热30 min，在波长625 nm 处测定溶液吸光度（optical density，OD）值，利用标准曲线测定样品的NH3-N 浓度；采用考马斯亮蓝法［11］在595 nm 波长处比色测定微生物蛋白（microprotein，MCP）浓度（A045-2，试剂盒购于南京建成生物工程研究所）；使用日本岛津GC-2014 型气相色谱仪测定挥发性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）浓度［12-13］。

其中VFA 浓度测定条件为：氢火焰离子检测器（FID，日本岛津有限公司），色谱柱为毛细管柱（FFAP，30.00 m×0.32 mm×0.50 μm）；升温条件为，初始 60 ℃，以 10 ℃·min-1升温至 120 ℃，保留 2 min，以 15 ℃·min-1升温至 180 ℃，保留 5 min，汽化室温度 250 ℃；FID 温度 250 ℃；进样量 1 μL，载气为高纯氮气（99.99%），压力0.7 MPa；氢气压力0.4 MPa，空气压力0.4 MPa，毛细管柱压力0.6～0.8 MPa，分流比 40∶1。

1.4.2 瘤胃微生物DNA 提取、测序 每组随机选择4 头牛的瘤胃液样品置于冰上解冻并充分混合，参考Denman 等［14］的CTAB 方法提取瘤胃样品基因组DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的纯度和浓度，取适量的样本于离心管中，用无菌水稀释样本至1 ng·μL-1。根据细菌16S rDNA 基因的V3～V4 区，合成带有Barcode 的特异引物。通用引物序列 515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′，806R：5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′。PCR 采用 25 μL 扩增体系；DNA 模板 5 ng，5 μmol·L-1的上、下游引物各 1 μL，2 ng·μL-1的牛血清白蛋白（BSA）3 μL，2×Taq Plus Master Mix 12.5 μL，双蒸水（ddH2O）补加至 25 μL；PCR 扩增条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，共 30个循环；72 ℃延伸 7 min。PCR 扩增产物用 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，用QIAquickPCR 纯化试剂盒（Qiagen，德国）纯化回收，符合要求的DNA 样品送至北京奥维森基因科技有限公司测序，测序平台为Mixed PE 300。

1.4.3 数据分析 测序平台得到的原始数据使用Trimmomatic（Version 0.36）软件去除低质量数据，然后通过vsearch 软件和物种数据库去除嵌合体，得到有效序列。筛选相似性在97%以上的序列生成OTUs，然后对OTU 聚类、物种分类学、多样性指数、群落结构进行统计分析。

1.5 数据统计与分析

试验数据用Excel 2016 初步整理后，采用SPSS 24.0 进行单因素ANOVA 模型方差分析，并用Duncan 氏法进行组间的多重比较，通过正交多项式比较精料补饲水平的线性和二次效应，P＜0.05 表示差异显著，结果均以平均值和标准误（standard error of mean，SEM）表示。

2 结果与分析

2.1 精料补饲水平对暖季放牧牦牛瘤胃发酵参数的影响

由表2 可知，随着精料补饲的提高，牦牛瘤胃液pH、乙酸浓度和乙酸/丙酸值呈线性和二次降低（P＜0.05）；补饲Ⅱ和Ⅲ组的微生物蛋白浓度显著高于其他两组（P＜0.05）；瘤胃总挥发性脂肪酸（total volatile fatty acids，TVFA）、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸浓度随精料补饲水平的提高呈线性和二次提高（P＜0.05）。结果表明，适当提高精料补饲水平，促进了暖季牦牛瘤胃发酵。

表2 精料补饲水平对暖季放牧牦牛瘤胃发酵参数的影响Table 2 Effect of different concentrate supplement levels on rumen fermentation parameters of grazing yaks in the warm season

2.2 精料补饲水平对暖季放牧牦牛瘤胃细菌丰富度与多样性的影响

由图 1 可知，4 组共产生 3138个 OTU，其中对照组、补饲Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组分别产生 2482、2285、2252 和 2014个OTU；相 对 应 的 独 有 OTU 数 目 分 别 为 183、169、90、106个，共 有 OTU 数目为 1337个 ，占 总 OTU 数 目 的42.61%。由图2 可知，随着测序深度的增加，4 组瘤胃细菌稀释曲线趋于平缓，说明测序程度已基本覆盖到样品中所有的细菌物种。通过α 多样性分析（表3）可知，随着精料补饲水平的提高，牦牛瘤胃液细菌的物种数、Chao1指数和香农（Shannon）指数呈线性和二次降低（P＜0.05），细菌覆盖率在各组间无显著差异（P＞0.05）。通过PCoA（图3）分析可知，不同精料补饲水平对暖季放牧牦牛瘤胃细菌群落结构的影响差异明显，其中补饲Ⅱ和Ⅲ组细菌结构较为接近。以上结果表明，精料补饲水平能显著影响暖季放牧牦牛瘤胃细菌的多样性，精料补饲水平越高，瘤胃细菌丰富度与多样性越低。

图3 PCoA 分析Fig.3 Analysis by principal co-ordinate analysis

表3 精料补饲水平对暖季放牧牦牛瘤胃细菌Alpha 多样性的影响Table 3 Effect of different concentrate supplement levels on alpha diversity of rumen bacteria of grazing yaks in the warm season

图1 OTU 韦恩图Fig.1 OTU venn diagram

图2 瘤胃细菌稀释曲线Fig.2 Sparse curve of ruminal bacteria

2.3 精料补饲水平对暖季放牧牦牛瘤胃细菌组成的影响

由表4 可知，在门水平上，随着精料补饲水平的提高，瘤胃拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度呈线性和二次提高（P＜0.05）；而厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度随精料补饲水平提高呈线性和二次降低（P＜0.05）；放线菌门（Actinobacteria）相对丰度随精料补饲水平的提高呈线性提高（P＜0.05）；其他菌门组间无显著差异（P＞0.05）。由表5 可知，在属水平上，随着精料补饲水平的提高，瘤胃普雷沃菌属_1（Prevotella_1）、克里斯滕森菌科_R-7（Christensenellaceae_R-7）及普雷沃氏菌科_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）相对丰度呈线性和二次提高（P＜0. 05）；而解琥珀酸菌属（Succiniclasticum）和瘤胃球菌科_UCG-005（Ruminococcaceae_UCG-005）相对丰度随着精料补饲水平的提高呈线性和二次降低（P＜0.05）。以上结果表明，精料补饲水平对暖季放牧牦牛瘤胃细菌结构有一定的影响。

表4 精料补饲水平对暖季放牧牦牛瘤胃细菌组成门水平的影响Table 4 Effect of different concentrate supplement phylum levels on the microbe composition of grazing yaks in the warm season（%）

表5 精料补饲水平对暖季放牧牦牛瘤胃细菌组成属水平的影响Table 5 Effect of different concentrate supplement genus levels on the microbe composition of grazing yaks in the warm season（%）

3 讨论

3.1 精料补饲水平对暖季放牧牦牛瘤胃发酵参数的影响

瘤胃挥发性脂肪酸（VFA）是反刍动物发酵日粮的产物，是机体的主要功能物质，也是反映瘤胃发酵功能的重要指标，其包括乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸。陈志龙等［15］研究发现，提高饲粮精粗比能显著降低绵羊瘤胃液pH 值。本研究结果表明，提高精料补饲水平，瘤胃液pH 值呈下降趋势，且补饲Ⅱ和Ⅲ组瘤胃液pH 值显著低于对照组，结果与其相一致。这可能是随着精料补饲水平的提高，牦牛摄入的非结构性碳水化合物的含量也上升，发酵后产生大量的VFA 和乳酸等物质，导致瘤胃液pH 值下降。瘤胃氨态氮（NH3-N）是瘤胃微生物利用饲料中的蛋白质合成的，也是瘤胃微生物蛋白（MCP）合成的前体，其浓度反映了瘤胃微生物分解含氮物质产生NH3-N 的速度及对其的摄取利用情况。本试验中，NH3-N 浓度随着精料补饲水平的提高而下降，而瘤胃液MCP 浓度上升，这与张莹莹等［16］和丁静美等［17］的研究结果一致。可能原因是瘤胃微生物快速发酵非结构性碳水化合物从中获得充足的能量，促进了微生物利用NH3-N 合成MCP 的速度，从而降低了瘤胃NH3-N 浓度。李岚捷等［18］研究发现，随着饲粮NFC/NDF 水平的提高，犊牛瘤胃丙酸、丁酸、戊酸和TVFA 浓度显著增加，而乙酸浓度和乙酸/丙酸值显著降低。占今舜等［19］研究也发现，提高饲粮精粗比，提高了湖羊瘤胃丙酸、丁酸、戊酸和TVFA 浓度。本研究中，随着精料补饲水平的提高，牦牛瘤胃丙酸、丁酸和TVFA 浓度显著增加，而乙酸浓度和乙酸/丙酸显著降低，与以上研究结果相一致。丙酸是反刍动物体内主要的生糖前体，促进丙酸的生成对提高反刍动物生长性能具有重要的现实意义，因此适当提高暖季放牧牦牛的精料补饲水平能够提高瘤胃菌体蛋白与丙酸浓度，进而提高牦牛的生长性能，前期的研究中补饲Ⅲ组的平均日增重最高达到834.00 g［8］也验证了这一结果。

3.2 精料补饲水平对暖季放牧牦牛瘤胃细菌丰富度与多样性的影响

16s rDNA 高通量测序技术可以快速，高效地了解瘤胃微生物菌群的结构与种类，因此通过该技术能够全面了解精料补饲水平对暖季放牧牦牛瘤胃菌群的影响。Chao1 指数通常用来表示菌群丰富度指标，其值越大表明菌群丰富度越大；香农（Shannon）指数是衡量菌群多样性的指标，其值越大表明菌群多样性越高。周力等［20］研究发现，补饲精料降低了藏羔羊瘤胃细菌多样性与丰富度。Liu 等［21］研究也发现，提高饲粮中精料比例，显著降低了牦牛瘤胃细菌Chao1 和Shannon 指数。本研究中，随着精料补饲水平的提高，牦牛瘤胃细菌OTU 数目和Alpha 多样性指数下降，与以上研究结果相一致。

3.3 精料补饲水平对暖季放牧牦牛瘤胃细菌组成的影响

饲粮组成是影响反刍动物瘤胃微生物的主要因素之一，饲粮精料水平会直接影响瘤胃微生物的组成与数目。有研究表明，拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）是反刍动物的优势菌门，拟杆菌门是降解碳水化合物的主要细菌，而厚壁菌门主要参与纤维物质的分解，两者在瘤胃发酵过程起着至关重要的作用［22-23］。本研究也得到相似的结果。林波等［24］用0∶100、35∶65 和50∶50 三种精粗比饲粮饲喂泌乳期水牛时发现，全粗料组瘤胃细菌拟杆菌门的丰度显著低于其他两组，而厚壁菌门的丰度显著高于其他两组。本研究中，随着精料补饲水平的提高，牦牛瘤胃细菌拟杆菌门的丰度随着上升，而厚壁菌门丰度随着下降，与以上结果相似，说明补饲提高了牦牛瘤胃中非纤维降解菌的生长增殖。放线菌门（Actinobacteria）是一类革兰氏阳性菌，具有分支的纤维和孢子，其大部分是腐生菌，也有寄生菌，可致病［25］。本研究中，提高精料补饲水平能够提高牦牛瘤胃放线菌门的丰度，表明生产中牦牛要适度补饲。

在属水平上，普雷沃氏菌是反刍动物瘤胃广泛存在的菌属，隶属拟杆菌门，参与瘤胃内的多种代谢活动，主要降解日粮中的半纤维成分，具有高活性的半纤维降解功能，并且普雷沃氏菌产生大量的复合酶，促进非纤维性多糖和蛋白质的降解［26］。本研究中，牦牛瘤胃优势菌属为普雷沃菌属_1（Prevotella_1）、克里斯滕森菌科_R-7（Christensenellaceae_R-7）和理研菌科_RC9（Gikenellaceae_RC9），这与张林［27］的研究结果相一致，与肖润等［28］的研究不太一致。可能是动物品种、生理阶段、饲粮结构和年龄不同等导致。高雨飞［11］研究发现，高精组锦江牛瘤胃普雷沃菌属的丰度显著高于粗料组，本研究结果与其基本一致，即随着精料补饲水平的提高，牦牛瘤胃中普雷沃菌属_1 和普雷沃氏菌科_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）的丰度随着上升。克里斯滕森菌科属于厚壁菌门，对维持胃肠道结构、功能和动物机体免疫调节有着重要作用［29］。本研究中，瘤胃克里斯滕森菌科_R-7（Christensenellaceae_R-7）的丰度随着精料补饲水平的提高呈增加的趋势，且补饲Ⅲ组显著高于放牧组，说明适宜的精料补饲水平有助于提高暖季放牧牦牛的免疫力。有研究报道，解琥珀酸菌（Succiniclasticum）丰度与饲粮纤维成分有密切联系，可以降解纤维或纤维二糖产生琥珀酸和乙酸等物质［30］。本研究中，补饲显著降低了牦牛瘤胃中解琥珀酸菌的丰度，可能原因是补饲提高了牦牛非纤维物质的摄入量，增加了非纤维性多糖和蛋白质的摄入量，进而导致瘤胃中解琥珀酸菌丰度下降。瘤胃球菌属主要包括黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌，能够产生大量的纤维素酶，是主要的纤维分解菌［31］。张雪娇等［32］研究发现，山羊瘤胃中瘤胃球菌科_UCG-005（Ruminococcaceae_UCG-005）的丰度随着饲粮NDF 水平提高而升高，本研究结果与其相似，说明提高精料补饲水平抑制了纤维降解菌的生长。

4 结论

在本试验条件下，精料补饲水平为2.5 kg·d-1时能促进暖季放牧牦牛瘤胃发酵，降低细菌丰富度与多样性；提高瘤胃拟杆菌门和放线菌门的丰度，但降低厚壁菌门的丰度；提高普雷沃菌属_1、克里斯滕森菌科_R-7 和普雷沃氏菌科_UCG-001 的丰度，但会降低解琥珀酸菌属的丰度。结果表明，适宜提高精料补饲水平能够促进暖季放牧牦牛瘤胃发酵，提高瘤胃部分淀粉降解菌的丰度，进而提高其生长性能。