持续风沙流胁迫对黑果枸杞叶片生理特性的影响

2022-07-08魏林源张莹花侍新萍

草地学报 2022年6期

党绪，马瑞*，魏林源，张莹花，侍新萍

(1. 甘肃农业大学林学院，甘肃兰州 730070； 2. 甘肃省治沙研究所，荒漠化与风沙灾害防治重点实验室，甘肃兰州 730070)

风沙流是风与其所搬运的固体颗粒组成的气固二相流。在我国西北地区，由于大风天气常年出现[1]，风沙流活动频繁，严重影响当地植物生存繁衍。一方面，风沙流通过摇曳、击打、磨蚀对植物造成机械损伤；另一方面间接通过改变周围气流，引发植物内部失水，导致其生理特性产生一系列变化[2]。此前，关于风沙流对植物的影响研究涉及风沙流对植物的生长状况[3-4]，光合蒸腾特性[5-6]，生物量分配[7]，表观特征[8]，解剖结构[9]等方面。而植物受到风沙流胁迫时，会通过形态改变[10-11]和生理适应[12]进行积极反馈，抗氧化酶活性和渗透调节物质发挥重要作用，因此选择长期生存在风沙环境中的植物，研究其抗氧化酶系统和渗透调节物质含量的变化，是了解植物在发展过程中如何适应风沙环境的重要基础。

赵丁洁等[1]研究发现8 m·s-1和17 m·s-1风沙流胁迫后，沙拐枣(CalligonummongolicmTurcz.)幼苗过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性有显著差异；赵哈林等[13]发现同一风沙流强度下随着风吹时间的增加，樟子松(Pinussylvestnisvar.mongolica)幼苗超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性下降，丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量、膜透性、POD活性、可溶性糖(soluble sugar，SS)和脯氨酸(proline，Pro)含量趋于增加；周瑞莲等[2]研究表明，随风沙流风速提高至15 m·s-1，黑松(PinusthunbergiiParl)在短时低风速吹袭时叶片平均MDA含量、细胞膜透性、SOD、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、POD活力较对照均有所升高；李道明等[14]研究发现不同强度风沙流胁迫下沙拐枣幼苗CAT活性均下降，POD活性均降低但大于对照；轻度风沙流胁迫下沙拐枣幼苗PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ最大效率(Fv′/Fm′)、PSⅡ运行效率(Fq′/Fm′)、非光化学淬灭系数NPQ变化均不明显；重度风沙流胁迫下，Fv/Fm、Fv′/Fm′、Fq′/Fm′和光化学淬灭系数qp均下降，NPQ则升高。

风沙流胁迫对植物抗氧化酶、渗透调节物质和荧光参数等的影响会因胁迫强度、胁迫时间和植物种类而异。黑果枸杞(Lyciumruthenicum)是茄科(Solanceae)枸杞属(Lycium)多棘刺灌木，适应性强，耐高温、耐寒耐旱，喜生于盐碱荒地，有防风固沙作用，可作为干旱、半干旱地区植被恢复重建的植物种[15-16]，野生黑果枸杞植株矮小，其生育期均处于风沙流侵袭高度范围内。目前，关于黑果枸杞在持续风沙流胁迫后生理特性如何变化研究较少。本试验以民勤和永靖种源黑果枸杞盆栽苗为研究对象，通过风洞试验模拟持续风沙流胁迫，记录在9 m·s-1风沙流胁迫过程中叶片形态变化，分析其经历胁迫后膜系统、抗氧化酶系统、渗透调节物质和荧光参数的变化规律，以期揭示民勤、永靖黑果枸杞在9 m·s-1风沙流持续胁迫后的生理响应机制，研究结果拓宽了植物逆境生理生态学理论，并为风沙地区黑果枸杞种植选育提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为3龄黑果枸杞盆栽实生苗，种子采自民勤青土湖区(103°02′～104°02′ E，38°05′～39°06′ N)和永靖县盐锅峡镇(102°53′～103°39′ E，35°47′～36°12′ N)野生黑果枸杞。2018年用采集的种子在育苗钵中育苗，待其长至10 cm后带土移栽至塑料盆中，每盆1株，置于甘肃省武威市治沙研究所绿洲站的苗圃内(102°35′ E，37°56′ N)培育，该地年平均气温7.8℃，降水量60～610 mm，蒸发量1 400～3 010 mm，日照时数2 200～3 030 h，无霜期85～165 d，是典型的大陆性气候。

2020年8月22日，选取长势良好且生物学特性无显著差异的民勤、永靖黑果枸杞作为供试材料，移至风洞实验室外通风、半荫蔽树冠下，浇等量水缓苗。

1.2 试验设计

风沙流模拟试验在甘肃省武威市治沙研究所的风沙环境风洞实验室完成。该风洞为直流下吹式，轴线风速在4～30 m·s-1连续可调，试验段长16 m。依据民勤和永靖季节性风速范围[17-18]，以往风吹研究报道中不同强度[2,19-20]、不同历时[13]风沙流对植物叶片的损害程度，以9 m·s-1风速对应的风沙流(输沙量为28.30 g·cm-1·min-1)进行胁迫。

2020年8月24日开始胁迫试验：在试验段铺满10～12 cm厚度的沙子，平整沙面后，选取4盆民勤供试黑果枸杞放于风洞出风口，调整植株高度，使其冠部处于风沙流吹袭范围内进行胁迫，胁迫时间为1 h。另做2个重复，每个重复为4盆供试枸杞。永靖种源胁迫处理与民勤相同，试验持续4 d。

每次胁迫结束后将植株搬至缓苗区，并记录叶片变化情况。第4 d胁迫结束后将植株搬至缓苗区静置30 min后快速随机剪取冠部上、中、下叶片，一部分带回实验室立即进行膜透性和荧光参数测定，另一部分用锡纸包裹经液氮移至超低温冰箱保存，用于其余生理生化指标测定。植株于风洞实验室外通风、半荫蔽树冠下进行恢复生长，第11 d再取样一次。试验前随机采集供试植株冠部上、中、下各部位叶片作为对照(CK)。

1.3 测定指标及方法

膜透性采用电导率法[19]测定；MDA含量采用硫代巴比妥酸法[19]测定；POD活性采用愈创木酚法[19]测定；SOD活性采用氮蓝四唑染色法[21]测定；CAT活性采用紫外吸收法[22]测定；可溶性蛋白(soluble protein，SP)含量采用考马斯亮蓝G-250法[21]测定；Pro含量采取酸性茚三酮法[21]测定；采用叶绿素荧光图像分析系统(CF imager，UK)测定叶片的叶绿素荧光参数，各参数计算将由内置软件自动记录并控制运行，具体测定程序参照师生波等[23]的方法。测定时，每个指标均做6个重复。

1.4 数据处理

运用SPSS 19.0统计分析软件对实验数据进行分析。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，Duncan法对同一种源不同取样时间内的差异性进行分析(P<0.05)；采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)检验种源和胁迫后不同时间及其交互作用对各生理指标的影响。用Microsoft Excel 2010制作图表。

2 结果与分析

2.1 风沙流胁迫下黑果枸杞叶片形态受损情况

风沙流胁迫第1 d，永靖黑果枸杞较民勤落叶更多，民勤有极少量嫩叶出现褐色斑块；风沙流胁迫第2 d，民勤叶片多数出现褐色斑块、弯曲，永靖只有少数叶片出现褐色斑块；风沙流胁迫第3 d，民勤有褐色斑块叶片数量增多、弯曲、少量嫩茎断裂，永靖有褐色斑块叶片数量增多，二者叶片均有萎蔫；风沙流胁迫第4 d，民勤叶片整体萎蔫、部分叶片发黑脱落，永靖有褐色斑块的叶片数量增多；第11 d，两种源叶片萎蔫(表1)。胁迫过程中两种源黑果枸杞均有落叶，第3 d胁迫后叶片出现积沙。可见，风沙流导致黑果枸杞叶片受损，出现褐色斑块，萎蔫。

表1 风沙流胁迫对黑果枸杞叶片形态的影响Table 1 Effects of wind-sand flow stress on the leaf morphology of Lycium ruthenicum

2.2 风沙流胁迫下黑果枸杞叶片膜透性和MDA含量变化

民勤和永靖叶片MDA含量在第4 d分别较CK显著(P<0.05)增加24.6%，13.0%；民勤叶片在第11 d较CK显著(P<0.05)下降了24.0%，而永靖叶片则较CK显著(P<0.05)增加了13.9%(图1A)。民勤、永靖叶片膜透性在第4 d与CK无显著差异，均在第11 d最大，分别较CK显著(P<0.05)增加了56.05%，25.91%(图1B)。可见，持续4 d风沙流胁迫导致永靖叶片MDA含量持续积累，而民勤叶片MDA仅在第4 d增加；胁迫后在第11 d，黑果枸杞叶片细胞膜透性增大。

图1 风沙流胁迫对黑果枸杞叶片MDA含量和膜透性的影响Fig.1 Effects of wind-sand flow stress on the MDA content and membrane permeability in the Leaves of Lycium ruthenicum注：不同小写字母表示同一种源不同时间之间差异显著(P<0.05)，下同Note：Values with different lowercase letters indicate significant differences between different times in the same seed source at the 0.05 level,the same as below

2.3 风沙流胁迫下黑果枸杞叶片抗氧化酶活性变化

民勤、永靖叶片CAT活性均先增后减，在第4 d有最大值，分别较CK显著(P<0.05)增加了104.04%，44.38%(图2A)。民勤叶片POD活性先减后增，在第4 d有最小值，较CK显著(P<0.05)下降了33.08%，永靖POD活性先增后减，在第4 d有最大值，为CK的3.01倍(图2B)；民勤叶片SOD活性先减后增，在第11 d较CK显著(P<0.05)增加，而永靖SOD活性呈下降趋势，与CK差异不显著(P<0.05)(图2C)。民勤叶片主要通过提高CAT、SOD活性，永靖叶片主要通过提高CAT、POD活性来减轻持续风沙流胁迫对其细胞造成的损伤。

图2 风沙流胁迫对黑果枸杞叶片抗氧化酶活性的影响Fig.2 Effects of wind-sand flow stress on the protective enzyme activity in the leaves of Lycium ruthenicum

2.4 风沙流胁迫下渗透调节物质含量变化

民勤叶片Pro含量逐渐积累，在第11 d有最大值，较CK显著(P<0.05)增加了149.82%，永靖叶片Pro含量先降后增，但均小于CK含量(图3A)。民勤、永靖叶片SP含量均逐渐减少，在第11 d时有最小值，分别较CK显著(P<0.05)降低了11.98%，19.97%(图3B)。风沙流胁迫后，民勤叶片通过增加Pro含量来减轻其所受伤害，永靖叶片渗透调节作用有限。

图3 风沙流胁迫对黑果枸杞叶片渗透调节物质含量的影响Fig.3 Effects of wind-sand flow stress on osmotic regulation substances in the leaves of Lycium ruthenicum

2.5 风沙流胁迫下叶片叶绿素荧光参数的变化

由图4A可知，民勤叶片Fv/Fm在受到风沙流胁迫后逐渐下降，但与CK差异不显著(P<0.05)，永靖叶片Fv/Fm先减后增，在第4 d较CK显著(P<0.05)下降了7.8%，第11 d与CK无显著(P<0.05)差异。

在低稳态光(400 μmol·m-2·s-1)照射下，民勤叶片PSⅡ最大效率(Fv′/Fm′)，PSⅡ运行效率(Fq′/Fm′)和光化学猝灭系数qp均呈下降趋势，在第11 d有最小值，且在第11 d与CK存在显著(P<0.05)差异，非光化学猝灭系数NPQ先减后增，但均与CK差异不显著(P<0.05)；永靖叶片Fv′/Fm′先减后增，在第11 d较CK显著(P<0.05)增加了6.40%，Fq′/Fm′、qp呈下降趋势，第11 d有最小值，NPQ先增后减，但均与CK差异不显著(P<0.05)(图4B、图4C、图4D、图4E)。在高稳态光(1 500 μmol·m-2·s-1)照射下，民勤Fv′/Fm′、Fq′/Fm′、qp先减后增，Fv′/Fm′、Fq′/Fm′在第4 d较CK显著(P<0.05)下降，第11 d与CK无显著(P<0.05)差异，NPQ先增后减，但均与CK无显著(P<0.05)差异；永靖Fv′/Fm′、NPQ先增后减，在第4 d有最大值，Fq′/Fm′呈增加趋势、qp先减后增，均在第4 d与CK差异不显著(P<0.05)，在第11 d达到最大值(图4F、图4G、图4H、图4I)。

图4 风沙流胁迫对黑果枸杞叶绿素荧光参数的影响Fig.4 Effects of wind-sand flow stress on Chlorophyll fluorescence parameters in the leaves of Lycium ruthenicum

2.6 种源和时间对黑果枸杞叶片各生理指标的双因素方差分析

由表2可知，种源对黑果枸杞叶片MDA含量，CAT、POD和SOD活性，Pro和SP含量，1 500 μmol·m-2·s-1光强下Fv′/Fm′、Fq′/Fm′有显著(P<0.05)影响；胁迫后时间对黑果枸杞叶片MDA含量、膜透性、CAT和POD活性，Pro和SP含量、Fv/Fm、400 μmol·m-2·s-1和1 500 μmol·m-2·s-1光强下Fv′/Fm′、Fq′/Fm′、qp有显著(P<0.05)影响；种源和时间的交互作用对MDA含量、POD和SOD活性，Pro和SP含量、Fv/Fm、400 μmol·m-2·s-1光强下Fv′/Fm′、Fq′/Fm′、NPQ及1 500 μmol·m-2·s-1光强下Fv′/Fm′、Fq′/Fm′均有显著(P<0.05)影响。

表2 种源和时间对黑果枸杞叶片各生理指标的双因素方差分析Table 2 Double factor variance analysis of seeding sources and times on physiological indexes of Lycium ruthenicum leaves

3 讨论

植物受到逆境胁迫时，体内自由基产生与清除的平衡被打破，过量的自由基积累破坏细胞[24]，导致膜脂发生过氧化反应，其产物MDA积累[25]；发生脱脂化反应，膜透性增大[21]，因而MDA含量和细胞膜透性是衡量质膜受伤害程度的重要指标。有研究表明，风沙流胁迫下霸王(Zygophyllumxanthoxylum)叶片[26]和沙蒿(Artemisiasphaerocephala)叶片[27]MDA含量并未显著增加，本研究结果与之不同，在第4 d风沙流胁迫后，两种源叶片MDA含量均显著增加，发生明显膜脂过氧化反应，这主要是因为在霸王和沙蒿的研究中风沙流胁迫时间分别为20 min和30 min且均为单次胁迫，而本试验胁迫时间为1 h且持续4 d，导致自由基大量积累，MDA含量显著增加。第11 d，民勤叶片MDA含量显著低于第4 d含量，而永靖叶片MDA含量高于第4 d含量，这可能是因为在第11 d民勤叶片CAT、SOD活性及Pro含量显著增高，协调清除产生的自由基，因此MDA含量显著降低，而永靖叶片只有POD活性显著升高，清除作用有限。第11 d两种源叶片膜透性均增大，风沙流胁迫过程中沙粒击打、磨蚀黑果枸杞产生的作用在其此后生长过程中逐渐表现出来，其伤害具有一定程度的滞后性。植物受逆境胁迫时会积极启动抗氧化酶系统，提高CAT、SOD、POD活性，清除活性氧，以保护植物细胞膜[28]，同时，通过渗透调节积累溶质，提高Pro、SP等的含量维持细胞膨压或渗透平衡、提高细胞液浓度等保护植物[29-30]。杨永义等[20]研究发现，20 min风和风沙流胁迫会提高民勤黑果枸杞叶片POD活性，本试验中民勤叶片POD活性在第4 d显著下降，这可能是因为本试验中风沙流持续时间较长，胁迫后POD活性受到了抑制，这与张荣梅等[31]和姜霞等[32]对黑果枸杞耐盐性的研究中POD活性变化类似。在第4 d，永靖Pro含量明显下降，可能是因为持续风沙流胁迫导致其细胞严重失水，结构和功能受到损伤，Pro合成能力受到抑制[33]，且在第11 d尚未完全恢复。SP含量减少，可能是因为胁迫后植物蛋白质合成受阻，加速分解成各种氨基酸通过降低叶片水势[34]来减轻黑果枸杞的受害程度。

叶绿素荧光反应植物光能吸收，激发能传递和光化学反应，作为光合作用的探针，几乎可以反映所有光合作用过程[35-36]。Fv/Fm作为衡量植物叶片中PSⅡ原初光能转换效率高低的重要依据，在没有受到胁迫时该参数很稳定(0.80～0.85)[37]，永靖叶片Fv/Fm在第4 d风沙流胁迫后显著下降，第11 d没有风沙流胁迫时恢复至正常水平，这说明风沙流胁迫后永靖黑果枸杞受到了光抑制而非光破坏，风沙流对其叶片PSⅡ反应中心造成的损伤可恢复。Fv′/Fm′反映开放的PSⅡ反应中心原初光能捕获效率[37]；PSⅡ运行效率(Fq′/Fm′)是实际电子传递的量子效率，反映电子在PSⅠ和PSⅡ的传递情况[38]；qp表示PSⅡ天线色素吸收的光能用于光化学电子传递的份额，一定程度上可衡量PSⅡ反应中心的开放比例[39]；NPQ则表示PSⅡ所吸收的光能不能用于光合电子传递，而是以热能耗散，对植物光合机构免受伤害起到了积极作用[40-41]。第4 d，低光强(400 μmol·m-2·s-1)下民勤、永靖叶片Fv′/Fm′、Fq′/Fm′及高光强下民勤Fv′/Fm′、Fq′/Fm′均下降，这说明风沙流胁迫导致黑果枸杞叶片PSⅡ反应中心原初光能捕获效率降低、PSⅡ实际传递的量子效率降低，从而导致从天线上捕获的光能用于光化学的份额减少，PSⅡ实际量子产量反应中心的光化学活性减弱[42]。第11 d高光强(1 500 μmol·m-2·s-1)下民勤、永靖叶片Fv′/Fm′、Fq′/Fm′均增加，这说明胁迫后恢复过程中高稳态光强下PSII反应中心原初光能捕获效率增大，从而拥有较多的能量捕获陷阱；光能电子传递的量子效率增大，有利于维持植物的光能转化效率，同时为暗反应的碳同化积累更多的同化力。1 500 μmol·m-2·s-1光强下民勤、永靖叶片qp均先减后增，NPQ均先增后减，存在一定互补关系，即第4 d风沙流胁迫后，高光强下民勤、永靖黑果枸杞叶片吸收的光能以热量散失的能量增多，这与李德禄等[43]研究中水分胁迫后云杉属两种植物的qp和NPQ的变化类似；第11 d叶片吸收的光能则多用于电子传递，减少了以热能消耗的比例。